引言
蛋白質-蛋白質相互作用（PPIs）指一種蛋白質對另一種蛋白質的選擇性識別，其控制著細胞生命的三個關鍵維度：生長、存活和分化。這些相互作用的調節對於理解支配生物功能的細胞網絡和開發新的治療方法都是至關重要的。NEMO是NF-κB信號轉導中心的支架蛋白，不同的調節因子與NEMO的不同捲曲區域發生相互作用，但該蛋白的拓撲復雜性限制了抑制劑的設計。本文中作者通過小分子篩選和合理設計，全面阻斷了卡波西肉瘤皰疹病毒癌蛋白vFLIP與NEMO之間的相互作用。
先睹為快
作者單位
康奈爾大學醫學院（Ethel Cesarman & Paramjit S. Arora），紐約大學化學系（張穎凱教授），哈佛大學醫學院。
靶點
NEMO-vFLIP：NF-κB必須調節蛋白-病毒FLICE抑制蛋白（PDB ID：3CL3）
篩選數據庫
38,506個小分子：LOPAC (Sigma, 1280個), Enamine 3 (33,135個), NIH臨床(727個), HTRSC臨床(294個), Prestwick (1109個), Pharmakon (905個)
計算方法
結合口袋分析，丙氨酸掃描
計算軟件
AlphaSpace軟件
計算流程
為發現阻斷vFLIP-NEMO蛋白相互作用的有效抑制劑，本文中作者首先採用時間分辨熒光共振能量轉移法篩選了38,506個小分子，命中的9個小分子均未表現出特異性。隨後作者採用AlphaSpace軟件對vFLIP-NEMO晶體複合物結構進行了活性口袋分析，確定PPIs相互作用的關鍵氨基酸殘基主要位於NEMO的螺旋2上，結合丙氨酸掃描分析提供的氨基酸突變建議，最終設計了併合成了抑制劑CHD3NEMO，CHD3NEMO提升了口袋佔有率，表現出與vFLIP的高親和力，活性實驗也表明其可有效的阻斷vFLIP與NEMO之間的相互作用。
小分子抑制劑的高通量篩選
作者採用基於靶標的方法來發現vFLIP-NEMO相互作用的抑制劑。作者對數據集中的38,506個小分子採用時間分辨熒光共振能量轉移(TR-FRET)法篩選vFLIP抑制劑，命中了20個抑制率大於40%的小分子，並用劑量反應曲線進行了體外活性驗證，最終發現有9個化合物的IC50值小於65 μM，然而，命中小分子均沒有表現出對PEL細胞(BC-3)的特異性毒性，表明非特異性結果與vFLIP獨立機制有關。
圖1. vFLIP介導激活NF-κB 信號通路
圖片來源：Nature Communications
圖2. 使用TR-FRET分析篩查的前九個命中小分子
圖片來源：Nature Communications
活性口袋的分析
隨後，作者轉向利用理性設計的方法來開發特定的NEMO/vFLIP抑制劑。為確定PPIs中未被充分利用的口袋，作者從vFLIP-NEMO晶體複合物結構出發，利用AlphaSpace軟件來表徵殘基中心口袋，以設計能夠提升口袋佔有率、更加有效的NEMO/vFLIP抑制劑。結果產生了6個表面口袋：3個高容量口袋(與Helix 1上的Glu240、Helix 2上的Phe238和Helix 2上的Lys246相關聯)，2箇中等容量口袋(與Helix 1上的Ala233和Helix 2上的Asp242相關聯)，以及1個低容量口袋(與Helix 2上的His235相關聯)。
圖3. AlphaSpace設計
圖片來源：Nature Communications
NEMO捲曲螺旋結構的設計與評價
通過丙氨酸掃描計算揭示了PPIs相互作用的關鍵氨基酸殘基主要位於NEMO的螺旋2(Tyr234，His235，Phe238，Tyr241，Asp242，Ile245)上。基於該結果並結合AlphaSpace軟件計算結果所提供的氨基酸突變建議，作者對NEMO捲曲螺旋結構進行了優化設計，如將Lys246突變為Arg246可使口袋IV的佔有率從45%增加到75%，為了獲得最佳的螺旋間隙堆積，將關鍵熱點殘基Tyr234突變為Leu234等。另外，作者設計了非天然的環己胺作為谷氨醯胺衍生物(Qcy)，既保留了Glu240與vFLIP口袋襯裡殘基Phe53骨架之間的氫鍵，又將環己基延伸到疏水的vFLIP口袋中，具有良好的互補性。作者將突變建議與Qcy都整合到CHD3NEMO中，AlphaSpace預測CHD3NEMO將是vFLIP的高親和力配體，生物活性及機制研究也證實了該結果。本文所採用的方法是蛋白質-蛋白質相互作用研究的一種有效策略。
圖4. NEMO-vFLIP相互作用抑制劑的合理設計
圖片來源：Nature Communications
參考文獻
Sadek J, Wuo M G, Rooklin D, et al. Modulation of virus-induced NF-κB signaling by NEMO coiled coil mimics[J]. Nature Communications, 2020, 11(1): 1-14. DOI：10.1038/s41467-020-15576-3
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關鍵字: 蛋白 臨床 AlphaSpace
