撰文 | Gladiator
DNA甲基化在动植物的生命活动中发挥着重要的调节功能, 涉及基因组防御、异染色质形成、基因印记、X染色体失活、转座元件沉默等，并在多种肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用。哺乳动物中，DNA甲基化主要发生在CpG上，这是与DNA甲基转移酶DNMT家族蛋白有关【1】。
一般来说，几乎所有的后鞭毛生物基因组中均含有至少编码两个DNMT同系物的基因，分别编码维持DNA甲基化转移酶和从头甲基化酶【2,3】。但也有例外，一种人类真酵母病原体——新型隐球酵母（Cryptococcus neoformans）却只依赖编码维持DNA甲基化转移酶即可维持其必须的甲基化水平。该生物的甲基化依赖于由DMT5基因编码的胞嘧啶DNA甲基转移酶（DNMT） Dnmt5。这种酶广泛存在于真酵母和绿藻中，其中一些已被证明具有CG甲基化功能而影响核小体的定位。Dnmt5家族的具有一个N端染色质域（CD），其后是一个胞嘧啶甲基转移酶催化域，一个RING以及与SNF2型ATP酶相关的结构域【4】。5mC是真核生物中最常见的DNA甲基化修饰，最近研究表明，
在新型隐球酵母中，5mC主要集中在转座子富集的重复区域，并可能在转座子沉默过程中发挥重要的作用【5】。然而，新型隐球酵母Dnmt5是如何在分子水平上参与并发挥甲基化功能还有待深入研究。近日，美国加州大学旧金山分校生物化学与生物物理学系的Hiten D. Madhani课题组在Cell上发表题为Evolutionary Persistence of DNA Methylation for Millions of Years after Ancient Loss of a De Novo Methyltransferase的文章。该研究表明以新型隐球酵母中为研究对象，发现该物种5mC需要DNA甲基转移酶Dnmt5，特别是对该物种在失去DnmtX酶的背景下如何在进化过程中维持甲基化进行了详细阐述，并且提出，类似于达尔文基因组进化，表观基因组已经持续进化了近5亿年。
研究人员首先研究了新型隐球酵母中多种促进高效的DNA甲基化机制及相关的因子。 H3K9me，即组蛋白H3第9号赖氨酸的甲基化修饰，是异染色质最重要的表观遗传标志。在新型隐球酵母中，5mC修饰的基因组区域与H3K9me同时发生。通过信号肽结合试验以及荧光偏振等方法，表明H3K9me是Dnmt5 CD主要结合分子伴侣。为进一步明确是否有其它的因子参与甲基化过程，研究人员通过基因敲除新型隐球酵母的H3K9甲基转移酶，以及设计多种探针检测不同区域的甲基化程度，表明除H3K9me以外，还存在其它的分子参与对5mC水平的调控。在此基础上，研究人员进一步对H3K9me效应蛋白HP1复合体成员进行研究，在对新型隐球酵母HP1同源物Swi6进行敲除后，发现H3K9me通过Dnmt5的CD或Swi6招募Dnmt5来促进5mC。研究人员探讨了近期报道的在表观遗传学调控中发挥重要作用的一种多功能核蛋白UHRF1(Ubiquitin-like protein containing PHD and RING finger domains 1)，非变性凝胶电泳等试验证明Uhrf1选择性地结合半甲基化的DNA，同时结合对Clr4的敲除实验表明Uhrf1和 Clr4通过两条不同的途径影响5mC。
为研究Dnmt5在甲基化调控过程中的分子机制，研究人员分别从体内和体外证明了Dnmt5的甲基化维持酶的特性。体外研究过程中，通过对其底物甲基化状态以及加入三甲基化的H3K9肽进行体外反应（排除从头合成甲基化酶活性）的研究表明Dnmt5是一种维持酶，它在体外对半甲基化的底物有活性，且在一定条件下对未甲基化的底物无活性。在体内实验过程中，为排除Dnmt5可能在体内与其它辅因子共同作用改变其仅作为维持酶的性质。研究人员从细胞中去除Dnmt5使甲基化消失，然后重新引入Dnmt5。通过构建pGAL-DMT5表达系统，研究发现Dnmt5的瞬时抑制可导致5mC的持续损失；通过重新引入RI-DMT5等位基因明确DMT5能够有效维持DNA甲基化。此外，通过体外构建甲基化外源序列并将其整合到新型隐球菌酵母基因组，研究结果表明Dnmt5能够在非内源性序列上独立维持DNA甲基化，并且只限于CG位点。
为了明确在仅有Dnmt5的情况下，新型隐球酵母5mC是如何建立的，研究人员通过分析其所在银耳科的近源物种中DNA甲基化酶的进行情况，发现一些近源物种同样具有单拷贝的与Dnmt5同源的编码基因，而另外一些近源物种在进化过程中出现了DMT5的丢失。而在一些较远的物种中还预测存在另外一种甲基化酶DnmtX，并推测其可能是一种从头合成的甲基化酶。进一步通过功能性实验表明，现存的三种不同物种的DnmtX都能在新型隐球酵母中引发广泛的DNA甲基化，所有这三种DnmtX在体内都行驶从头甲基化酶功能，这有力地证明了祖先DnmtX也具有这种功能。为进一步了解远古丢失DnmtX后，5mC维持状况如何。研究人员对新型隐球酵母开展了实验进化实验，通过对其120代的连续观察发现99.0%以上的5mC位点可以维持。进一步探讨5mC模式的遗传模式，通过对跨越4个主要分枝于5百万年前分化的C. neoformans var grubii 8个分离株，发现在跨着丝粒区域和包含包含Tcn3元件的双LTR均存在共有的5mC位点，表明胞嘧啶甲基化位点在不同分离株间相对保守。此外，研究人员还对表观遗传的进化和选择进行分析，通过一系列的实验和进化研究表明新型隐球酵母中5mC是高保真度遗传的，5mC的损失和获得事件通过产生自然选择作用的随机变异，且以一种类似于DNA序列突变的方式进行。
总之，本研究利用多项分析技术并结合多种遗传学实验，表明新型隐球酵母在缺乏从头甲基化酶的背景下，以及数百万年来如何通过选择和罕见起源事件如何特异性地维持5mC。因为新型隐球酵母Dnmt5高度特异性维持胞嘧啶甲基化体系的特性，有关该物种的研究将继续为表观遗传记忆的机制基础和生物学作用提供见解。
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.12.012
参考文献
1. Bird, A. DNA methylation patterns and epigeneticmemory[J]. Genes & Development, 2002, 16(1):6-21.
2. Bewick A J , Vogel K J , Moore A J , et al.Evolution of DNA Methylation across Insects[J]. Molecular Biology andEvolution(3):3.
3. Bewick A J, Hofmeister B T, Powers R A, et al.Diversity of cytosine methylation across the fungal tree of life[J]. Nature ecology& evolution, 2019, 3(3): 479-490.
4. Huff J T, Zilberman D. Dnmt1-independent CGmethylation contributes to nucleosome positioning in diverse eukaryotes[J].Cell, 2014, 156(6): 1286-1297.
5. Yadav V, Sun S, Billmyre R B, et al. RNAi is acritical determinant of centromere evolution in closely related fungi[J].Proceedings of the National Academy of Sciences, 2018, 115(12): 3108-3113.
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