RDP Trio™ 试剂
RDP Trio™ Reagent
简介
RDP Trio™试剂用于从人、动物和植物样品中方便快捷地分离RNA、DNA和蛋白。获得的RNA可用于下游的Northern 杂交、mRNA分离、体外翻译、RT-PCR等。RNA长度从0.1~15kb，DNA可用于PCR、酶切、Southern杂交，蛋白可用于Western Blotting。
原理
RDP Trio™试剂为硫氰酸胍和苯酚的单相混合液，能有效溶解RNA。加入氯仿并离心后，溶液分为3相，水相含RNA，中间相含DNA，有机相含蛋白质。1ml RDP Trio™试剂可用于50-100 mg组织、5-10×10 6细胞、或 10 cm2平皿单细胞层。该方法对Chomczynski和Sacchi发明的RNA一步分离法进行了改进，可在1小时内完成。
操作流程
1) 样本制备
1a. 组织：采用匀浆器将样品和RDP Tri™o试剂试剂充分混匀， 1ml RDP Trio™试剂适合50-100mg组织
1b. 单细胞层: 在平皿中直接裂解细胞，10 cm2平皿单细胞层加1mlRDP Trio™试剂，用移液器吹打。平皿要求为玻璃皿，不能为塑料皿。
1c. 悬浮细胞：最多离心1×107细胞，4℃，300 × g，5min。弃上清，加1ml RDP Trio™试剂，反复吹打。（动物细胞、细菌、酵母、植物细胞数量均同上）
注意：
1. 细胞用RDP Trio™试剂匀浆或裂解后，在-70℃可放1个月时间。
2. 如果下列成分含量较高，可能需要额外的操作步骤，具体参考原版说明书：脂肪、蛋白、多糖和细胞外基质（如肌肉）。
2）相分离
将均质化的样品在室温（15-25℃）孵育5分钟，使核蛋白复合物完全解离。
每毫升RDP Trio™试剂加入200μl氯仿。盖紧样品，剧烈摇动15秒，在室温（15-25℃）下静置10分钟。将得到的混合液以12,000×g（≈13,000rpm）在4°C时离心15分钟。离心后，混合液分成底部深红色有机相（含蛋白质），中间相（含DNA）和无色含有RNA的上层水相。（以下继续下面相应的RNA/DNA/蛋白分离步骤）
注意：用于相分离的氯仿不应含有异戊醇和其他添加剂。
RNA分离步骤
1） RNA沉淀
将含有RNA的水相转移到新管中并加入500μl异丙醇。 让样品在室温（15-25℃）下静置5-10分钟。 在4℃下以12,000×g（≈13,000rpm）离心10分钟。通常在离心前不可见的RNA沉淀，在管底或侧面形成胶质状沉淀。
提示：2-8℃保存中间相（含DNA）和有机相（含蛋白质）。
2）RNA清洗
去除上清液而勿碰到沉淀。加入1ml75％乙醇清洗RNA沉淀。涡旋样品，然后在4℃下以 750×g（≈10,500rpm）离心5分钟。
3）RNA复溶
去除上清液而勿碰到沉淀。风干RNA沉淀5-10min。不要让RNA完全干燥。加50µl无RNA酶水溶解RNA。为方便溶解，可用移液器反复吹打。在55-60°C孵育10-15分钟。提取的RNA可在-80°C保存。避免反复冻融。
DNA分离步骤
1）DNA沉淀
去除中间相上面的水相。转移包含DNA的中间相至新管中。每mlRDP Trio™试剂中加入300μl无水乙醇。混匀，室温静置3min。4℃离心12000 ×g（≈13000rpm）5分钟。
2）DNA清洗
取上清，勿碰沉淀。上清2-8℃保存用于蛋白提取。用1 ml 含0.1M柠檬酸三钠和10%乙醇的溶液清洗DNA沉淀。DNA沉淀室温下静置30分钟。7500×g (≈10,500 rpm)4°C离心5分钟。弃上清，重复清洗1次。
弃上清，用1.5ml75%乙醇溶解DNA沉淀。再室温静置10~20分钟，再7500×g (≈10,500 rpm) 4°C离心5分钟。
提示：乙醇中的样本可在2-8°C保存几个月。
3）DNA复溶
弃上清，勿碰沉淀。风干DNA沉淀5~10分钟。加DNA沉淀中加100l洗脱缓冲液(10mM Tris-Cl, pH 8.5，货号DS0040) ，7500×g (≈10,500 rpm)4°C离心10分钟，以去掉不溶物。转移上清至新管中。纯化的DNA即为基因组DNA，2-8°C可保存1-2天。-20°C或-80°C可长期保存。避免反复冻融，因其可能造成DNA变性。洗脱液有助于稳定DNA。
蛋白分离步骤
1) 蛋白质沉淀
从纯化DNA第2步分离到的上清液中沉淀蛋白质。每ml RDP Trio™ 试剂加入1.5ml异丙醇。让样品在室温 （15-25℃）下静置10分钟。再在4℃下离心12,000xg（13,000rpm）10分钟。
2）蛋白质清洗
弃掉上清液而勿碰沉淀。加入2ml 0.3M盐酸胍、95％乙醇溶液洗涤沉淀。让沉淀在室温（15-25℃）静置20分钟。在4℃离心7,500 x g（10,500rpm）5分钟。弃去上清液并重复该洗涤步骤两次。弃去上清液，加2ml 96-100％乙醇，涡旋以溶解蛋白质沉淀。让样品在室温下（15-25℃）静置20分钟。再4°C下 以 7,500 x g（10,500rpm）离心5分钟。
3）蛋白质复溶
弃掉上清液而勿碰沉淀。将蛋白质沉淀短暂风干5-10分钟。向蛋白质沉淀添加适量的1％SDS。以7,500 x g（≈10,500rpm）4°C离心10分钟，以去除任何不溶物质。将上清液转移到新管中。
提取的蛋白质溶液可立即用于Western蛋白印迹或储存在-20℃。
存储条件及效期
15--25°C，效期1年
参考文献
1. Chomczynski P., BioTechniques 15,532-537(1993).
2. Chomczynski P. and Sacchi,N., Anal .Biochem.,162,156-159(1987).
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