COVID-19病毒核酸檢測專家共識

突發新型冠狀病毒COVID-19肺炎疫情以來，感染病例快速上升。隨著疫情的發展和防控力度加大，全國各地乃至境外均有病例報道[1,2,3,4]，及時對急重症及疑似患者進行診斷需要快速有效的方法，病毒核酸檢測可為診斷提供直接證據[5,6]。核酸檢測過程中因對病原體的傳染途徑和致病力尚未完全明確，工作人員在核酸檢測過程中存在較大的感染風險。此外，因為2019-nCoV基因結構與一般RNA差別較大，因此檢驗流程、檢驗質量和生物安全均需要有一定的指導。本共識在參閱國家衛生健康委員會相關文件、查閱文獻、諮詢重疫區相關專家的基礎上進行編寫，以對實驗室檢測工作提出有指導性的建議，本共識適用於從事2019-nCoV核酸檢測的所有實驗室。

適用範圍

適用於2019-nCoV核酸檢測，如採用逆轉錄PCR（RT-PCR）方法檢測等。

工作程序一、標本採集（一）標本採集人員

採集人員必須經過院感管理部門或上級管理部門舉辦的生物安全培訓，並考核合格。標本採集人員應按三級防護配備防護用品，包括工作服、防護服、一次性工作帽、醫用防護口罩（N95）、外科口罩、護目鏡、面罩、雙層手套、防水靴和鞋套[7,8]。配備防止病原微生物擴散和感染的設施，如處理感染性廢棄物的垃圾桶、處理緊急意外事件的藥具和具備一定的通風條件等。

（二）受檢人群

新型冠狀病毒肺炎疑似病例、確診病例或與上述二者有密切接觸史者[9]。

（三）標本採集及包裝

輕症患者、高度疑似患者或有密切接觸史者，標本採集優選順序為鼻咽拭子、口咽拭子、痰液，為提高陽性率，可同時採集1份鼻咽拭子和1份口咽拭子於同一標本採集管中；為觀察療效和控制傳染源，可對確診患者的糞便和血液進行檢測。

1．鼻咽拭子：

標本採集管先貼好條形碼，儘可能採集患者發病3 d內的鼻咽拭子標本。以拭子測量鼻尖到耳垂的距離並用手指做標記，將拭子以垂直鼻子（面部）方向插入鼻腔，拭子深入距離最少應達耳垂部位到鼻尖長度的一半，使拭子在鼻內停留15~30 s，輕輕旋轉3~5次，迅速將拭子放入裝有2 ml裂解液（與核酸提取試劑盒中裂解液相同）的標本採集管或含RNA酶抑制劑的細胞保存液中，插入拭子後在靠近頂端處折斷無菌拭子杆，旋緊管蓋並用封口膜封閉[10]。

2．口咽拭子：

標本採集管先貼好條形碼。儘可能採集發病3 d內患者的咽拭子標本。宜用無菌植絨拭子採樣，適度用力拭抹咽後壁部位，應避免觸及舌部；迅速將無菌拭子放入用於採集鼻咽拭子的採集管中，在靠近頂端處折斷無菌拭子杆，旋緊管蓋並用封口膜封閉[10]。

3．痰液：

標本採集管先貼好條形碼。收集痰液標本時不宜開放氣道收集標本。收集深部咳嗽痰液於一次性無菌旋蓋採樣杯中，採樣杯中裝入2 ml蛋白酶K（1g/L)[11]。收集痰液後旋緊杯蓋並用封口膜封口，儘可能30 min內送檢。如果需長距離運輸標本時不宜先添加蛋白酶K。

4．肺泡灌洗液（BALF）：

重症患者或病情進展迅速的肺炎患者，由臨床醫生無菌操作下吸取≥5 ml BALF到貼有標本條形碼並帶螺帽的50 ml無菌容器中。收集標本後旋緊標本蓋並用封口膜封口。

5．血液：

發病後7 d內或危重症患者，或考慮病毒血症患者，可採集血液標本。標本採集管先貼好條形碼。使用含有乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝劑的真空釆血管採集血液標本2~4 ml。

6．糞便：

如發病早期出現腹瀉等消化道症狀的患者，則留取糞便標本3~5 g(黃豆大小)。標本採集管先貼好條形碼。標本收集於含2 ml生理鹽水（有條件時可添加RNA酶抑制劑）的帶螺帽標本採集管中並用封口膜封口。

7．標本包裝：

採集標本後用75%乙醇噴灑標本採集管外部，立即放入標有"生物危險"密封袋中並封嚴封口；再用75%乙醇噴灑密封袋外部，然後放入標本轉運容器，並對轉運容器進行外部消毒，及時送檢。

二、標本運輸

標本應送至具備檢測資質並經省級衛生行政主管部門批准可從事2019-nCoV核酸檢測的PCR實驗室[12]。

1．送檢時間和溫度控制：

標本採集後應儘快送檢，採集後應儘可能在2～4 h內送到實驗室。在2 ～8 ℃下轉運，運送時間應不超過72 h。如超過72 h，應-70 ℃或更低的溫度下保存和轉運。血液標本應分離血漿後進行保存和轉運[9,13]。

2．運輸容器：

標本運輸容器應當防水、防破損、防洩露、耐高（低）溫和高壓。運輸容器和包裝材料上應有相關規定的生物危害標識、警示語和提示語。運輸容器應使用三層包裝系統，即內層容器、中層包裝和外層包裝。防漏的內層容器包裝後貼上生物危害標識，裝入中層容器，將"感染性物品"標記貼在外層包裝上。內層容器和中層容器間應放置足量的吸水性材料，中層容器應固定在硬質外層容器中。中層容器與外層容器間應放置凝膠冰袋[9,14]。

3．院內運輸：

標本運送人員進行二級防護並隨身攜帶75%乙醇，以便發生意外時能及時處理，標本運送時宜派兩人同行，條件允許時應配備標本轉運監控裝置。

4．長距離運輸：

若標本需要遠距離運輸，應當按照《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理規定》辦理《準運證書》[15]。2019-nCoV標本運輸包裝屬於A類，對應的聯合國編號為UN2814。轉運者安全防護按二級防護要求佩戴，並隨身攜帶75%乙醇。司機佩戴外科口罩或N95口罩，通過專用車輛運輸。如果經航空運輸，包裝還應符合國際民航組織文件Doc9284-AN/905《危險品航空安全運輸技術細則》[16]的PI602分類包裝要求[9]。至少由1名標本運送人員和司機同時轉運標本，宜配備標本轉運過程監控設施。

三、標本接收1．生物安全防護：

標本接收人員按二級防護佩戴防護設備。

2．標本簽收：

標本運送人員和接收人員對標本進行雙簽收。接收標本前應檢查標本轉運容器外包裝有無破損，打開容器前用75%乙醇對標本轉運容器進行噴灑或擦拭消毒。將標本轉運容器放入生物安全櫃，在安全櫃中打開標本轉運容器並立即用75%乙醇噴灑或擦拭消毒，取出標本密封袋後，對密封袋用75%乙醇噴灑或擦拭消毒，並檢查是否密封好，立即將標本放入專用冰箱冷藏保存[17]。

3．標本接收後保存：

標本接收後，若無法及時檢測，可於4 ℃條件下短期（不超過24 h）保存，若需長期保存，可將標本於-70℃或更低的溫度下保存[9]。

四、試劑準備1．試劑選擇參考意見：

至少含2019-nCoV基因的兩個位點（開放讀碼框1a/b、核殼蛋白N或E結構蛋白）[9]，反應體系大，加樣量大；檢測試劑最好能與核酸提取儀配套使用，此外可選用引物不同的試劑盒便於對結果複核。

2．安全防護：

建議按三級防護要求進行防護；當條件不允許且各工作區分工作業時，試劑配製人員至少應按《醫療機構臨床基因擴增檢驗工作導則》[18]穿工作服，戴一次性醫用帽子和手套。

五、標本前處理

標本前處理及核酸提取操作的工作人員應進行三級防護。標本前處理應在具有外排功能的生物安全櫃中操作。生物安全櫃中應配備兩個廢棄物桶，一隻桶中裝0.55%~1%含氯消毒液，另一隻桶中裝1 mol/L稀鹽酸。前一隻廢棄物桶用於丟棄標本、實驗過程中產生的廢液及與標本接觸過的實驗耗材；後一隻廢棄物桶用於裝接觸過核酸的耗材。廢棄物桶應完整並醒目地標示廢棄物內容。每次對標本進行操作後，用75%乙醇消毒後棄去外層手套，對內層手套用75%乙醇消毒後更換新外層手套。取出標本後用75%乙醇對標本外部進行噴灑或擦拭消毒。

（一）標本前處理1．口咽拭子和鼻咽拭子：

可直接用於核酸提取，當實驗室條件不夠時可增加病毒滅活步驟[9]，增加病毒滅活步驟可能會降低核酸檢測的靈敏度。

2．血液：

1 500×g離心10 min,，離心後冰浴3~5 min，吸取血漿提取核酸。

3　肺泡灌洗液和糞便：

應充分振盪混勻後進行病毒滅活。

4　痰液：

先在55 ℃下孵育15 min後再進行病毒滅活[11]。如果痰液標本採集杯中沒有預加蛋白酶K，則應在病毒滅活後重復此步驟。

（二）病毒滅活

提前將水浴箱預熱至56 ℃，在生物安全櫃內用75%乙醇對裝有標本的密封袋進行噴灑消毒，用吸水紙擦拭後放入水浴鍋中的試管架上，標本蓋上擱置重物，防止標本採集管漂浮。每隔10 min將標本搖勻1次（動作輕柔），滅活時間45 min[19,20]。可根據提取試劑在標本裂解時所採用的溫度調整滅活溫度，但不能低於56 ℃；提高溫度後可適當縮減滅活時間。滅活條件的優化最好有預實驗支持，保證標本能在有效溫度下有足夠時間滅活。

六、核酸提取和加樣1．實驗前消毒：

用75%乙醇對生物安全櫃的空間和檯面以及核酸提取儀進行消毒，並紫外線照射30 min。有條件時可在生物安全櫃操作檯面鋪一層吸水性材料[14]。

2．標本準備：

將滅活後的標本從水浴鍋中取出，在生物安全櫃內對密封袋進行消毒，打開密封袋後，即時用75%酒精消毒，取出標本，1 500×g離心5 min後冰浴3~5 min。在生物安全櫃內打開標本採集管，按核酸提取試劑說明書要求吸取一定量標本（動作輕柔）加入核酸提取試劑中。為保證人員安全和核酸提取純度和效率，建議採用基於磁珠吸附的自動化核酸提取方法。

3．標本處理後消毒：

採用75%乙醇對生物安全櫃、工作臺面、移液器等用品進行消毒[14]。

4．核酸擴增體系的準備：

核酸提取完成後，立即將提取物進行封蓋處理。在生物安全櫃內將提取核酸加至PCR擴增反應體系中。

5．實驗室消毒：

用75%乙醇對核酸提取儀進行處理並紫外線照射30 min。應在實驗室空氣中噴灑75%乙醇，10 min後開啟通風裝置通風10 min（注意防爆，密閉空間如果通風不夠，可適當延長通風時間），再開啟實驗室紫外燈照射30 min。紫外線照射後，工作人員可著一次性醫用帽子、手套、隔離服、鞋套進入實驗室，用1 mol/L的鹽酸處理工作臺面和地面，並開啟實驗室通風裝置通風1 h後用清水清潔檯面和地面[18]，最後可用過氧化氫消毒儀進行終末消毒[21]。

七、核酸擴增1．安全防護：

建議按三級防護要求進行防護，當條件不允許且各工作區分工作業時，擴增區工作人員可按二級防護佩戴防護用品，即穿隔離衣，戴一次性醫用帽子、醫用防護口罩（N95）、面罩、鞋套和單層手套。按試劑說明進行操作。

2．核酸擴增：

將擴增體系放入擴增儀，核對擴增程序是否與試劑說明書相符，啟動擴增程序，待反應開始後離開實驗室。

3．擴增產物處理：

擴增後產物置於含1 mol/L的稀鹽酸中，應將產物全部浸泡至液體中，浸泡後將擴增產物轉移出實驗室[13]。如果擴增後產物未在擴增區浸泡稀鹽酸，可將擴增產物用一次性醫療垃圾袋裝好紮緊，轉移至擴增產物廢物處理區。

4．實驗室消毒：

擴增完成後用75%乙醇對空氣進行消毒，10 min後開啟通風裝置通風10 min，同樣要注意通風的效果，防止密閉空氣中酒精引發爆炸的危險，再用紫外燈照射30 min。紫外線照射後，工作人員著工作服、一次性醫用口罩和帽子進入實驗室，用1 mol/L稀鹽酸擦拭檯面和地面，清潔後應及時通風，通風時間不得少於1 h，再用清水清潔檯面和地面[18]。

結果解釋一、報告方式

建議報告為"檢出"、"未檢出"和"可疑"，對3種報告方式進行充分的結果解釋，並對下一步工作提出建議。

二、判讀條件1．判讀為"檢出"的條件：

需滿足以下任一條：（1） ORF1ab和N基因同時陽性時，判定為陽性；（2）若僅ORF1ab或N基因其中之一檢測結果陽性時，需重新提取原標本的核酸進行復查，複查後ORF1ab或N基因仍為陽性時，判定為陽性[9]。

2．判讀為"可疑"結果的處理：

當出現以下兩種情況時為"可疑"：（1）2個位點的Ct值位於陽性Ct值和陰性Ct值之間或其中1個位點判讀為陽性，另1個位點的Ct值位於陽性Ct值和陰性Ct值之間（具體請參考試劑盒說明書）；（2）2個位點中的1個位點為陰性，另1個位點的Ct值位於陽性Ct值和陰性Ct值之間。對於"可疑"陽性結果，建議對標本重新進行一次核酸提取，並與該標本前一次提取的核酸同時擴增檢測，結合兩次檢驗，2個位點可判斷為"陽性"則可報告"檢出"，否則應報告"可疑"。當報告為"可疑"時，實驗室應考慮以下措施：（1）更換不同廠家的試劑盒重複實驗或採用敏感度更高的方法，如數字PCR方法進一步確定；（2）建議臨床重新採集標本或更換部位採集標本再次檢測。

3．判讀為"未檢出"結果的處理：

當兩個位點擴增結果無反應，可報告"未檢出"，並對結果進行解釋，此情況可能是病毒載量低於檢出限，應結合臨床分析。當臨床體徵及其他檢查高度懷疑2019-nCoV感染時，建議重新採集標本或更換部位採集標本再次檢測。

質量控制1．人員培訓：

標本採集人員應熟練掌握採集方法；實驗室工作人員應準確掌握工作流程和操作。

2．標本採集：

標本採集管中如果加入了裂解液或蛋白酶K，應注意有效期和保存條件符合要求。

3．標本運輸：

標本要及時送檢，院內運輸最好在採集後30 min內，送檢時標本包裝容器中應放置含凝膠的冰塊，並監測運輸過程中的溫度。

4．標本接收與處理：

標本接收後應及時處理，特別是痰液和口/鼻咽拭子，因為這些標本中加入了痰液液化劑或裂解液，操作時間延長將導致核酸的降解。

5．質控品的使用：

試劑盒中陽性質控品/對照品應及時取出，放置於標本製備區的冰箱中。可將陽性樣本的核酸分裝凍存，用作陽性對照以驗證試劑的有效性。實驗室條件允許的情況下，可將陽性標本滅活後當成陽性質控品使用，陽性質控應選用濃度相對較低的標本。

6．設置充分的對照：

包括試劑對照、陰性對照和陽性對照。陰性對照可選用無菌水，每天實驗結束後配製3~5份無菌水（2 ml試管加入無菌水）分別放置於標本製備區和擴增區，用於實驗室汙染控制。陰性對照和質控品均應與標本平行操作。

7．正確使用75%乙醇：

在實驗過程中應合理減少75%乙醇的使用量，在操作過程中不能採用75%乙醇對空氣消毒。

8．降低氣溶膠形成風險：

標本前處理過程中動作應輕柔，減少氣溶膠形成。

9．優化工作流程：

操作過程合理會節省時間，可減少核酸降解；因三級防護裝備穿戴和更換比較費時，進行2019-nCoV核酸檢測宜分工合作，以避免各室間核酸汙染。

10．室內質控方法：

在檢測一定數據後可依據本實驗室陽性率進行控制，依據二項式分佈計算陽性概率，製作P控制圖，當陽性率超過控制範圍時應停止實驗，查找原因，徹底去除汙染後才能開展檢測工作。

廢棄物處理1．人員要求：

處理廢棄物的人員必須經過院感科或上級管理部門舉辦的生物安全培訓，取得培訓合格證書，並具備相應的專業技能。

2．感染性廢棄物處理：

與標本接觸過的醫療廢物，如tip頭、採樣管、小離心管（如EP管）等應用0.55%~1%含氯消毒液處理，用三層醫療廢物包裝袋（標有"感染性廢物"）裝好紮緊後轉出實驗區，經高壓滅菌後按醫療廢物處理[22]。防護服、鞋套、手套、口罩用75%乙醇消毒後收集於三層醫療廢物包裝袋（標有"感染性廢物"）中。經高壓後按醫療廢物處理[22]。

3．處理核酸的廢棄物處理：

標本提取與加樣過程中與核酸接觸過的材料，如tip頭、EP管、核酸提取槽等浸泡於稀鹽酸中，浸泡時間不少於1 h，浸泡後用醫療廢物包裝袋裝好並紮緊，經高壓後按醫療廢物處理。

4．核酸擴增產物終處理：

建議擴增產物在專門的房間進行終處理，將浸泡於稀鹽酸中的產物在稀鹽酸液體中開蓋，切記不能在空氣中開蓋，浸泡過核酸的鹽酸用鹼進行中和後可按醫療廢水處理，擴增用的試管，如八聯管經高壓後按醫療廢物處理。

5．廢棄物的安全管理：

操作人員應及時處理廢棄物，並做好登記。不得私自將廢棄物帶離實驗區。

執筆者：劉子傑（昆明醫科大學第一附屬醫院醫學檢驗科）；童永清（武漢大學人民醫院醫學檢驗中心）；伍均（上海市第一人民醫院醫學檢驗科）；杜魯濤（山東省第二人民醫院醫學檢驗科）；魏超君（甘肅省人民醫院臨床研究與轉化醫學研究所）

共識制定專家組成員（按姓氏漢語拼音排序）：崔巍（中國醫學科學院腫瘤醫院檢驗科）；曹永彤（中日友好醫院醫學檢驗科）；陳鳴（西南醫院醫學檢驗科）；蔡貞（南方醫科大學南方醫院）；段勇（昆明醫科大學第一附屬醫院醫學檢驗科）；丁海濤（內蒙古自治區人民醫院醫學檢驗科）；杜魯濤（山東省第二人民醫院醫學檢驗科）；關明（復旦大學附屬華山醫院醫學檢驗科）；郭瑋（復旦大學附屬中山醫院醫學檢驗科）；高春芳（第二軍醫大學附屬東方肝膽外科醫院醫學檢驗科）；郝曉柯（第四軍醫大學西京醫院醫學檢驗科）；胡成進；（濟南軍區總醫院醫學檢驗科）；黃山（貴州省臨床檢驗中心）；姜豔芳（吉林大學第一醫院醫學檢驗科）；劉子傑（昆明醫科大學第一附屬醫院醫學檢驗科）；李萍（湖南中醫藥大學第一附屬醫院醫學檢驗科）；李卓（西安醫學院第一附屬醫院醫學檢驗科）；明亮（鄭州大學第一附屬醫院醫學檢驗科）；沈佐君（中國科學技術大學附屬第一醫院科技處）；蘇建榮（首醫附屬北京友誼醫院醫學檢驗科）；孫自鏞（華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院醫學檢驗科）；童永清（武漢大學人民醫院醫學檢驗中心）；王成彬（中國人民解放軍總醫院醫學檢驗中心）；王輝（北京大學人民醫院醫學檢驗科）；汪俊軍（東部戰區總醫院醫學檢驗科）；伍均（上海市第一人民醫院醫學檢驗科）；魏超君（甘肅省人民醫院臨床研究與轉化醫學研究所）；許斌(江蘇省腫瘤醫院省臨檢中心);於農(上海交通大學附屬新華醫院蘇州分院醫學檢驗科)；鄭磊（南方醫科大學南方醫院）；張義（山東大學齊魯醫院醫學檢驗科）；張新（新疆生產建設兵團醫院醫學檢驗科）；張櫻（中國人民解放軍總醫院醫學檢驗中心）

利益衝突

利益衝突　所有作者均聲明不存在利益衝突

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