高通量測序全面檢測生物或環境樣本的單細胞真核生物和寄生蟲
A high-throughput sequencing assay to comprehensively detect and characterize unicellular eukaryotes and helminths from biological and environmental samples
Microbiome, [9.133]
DOI: https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-018-0581-6
第一作者：Matthew V Cannon
通訊作者：David Serre [email protected]
主要單位：馬里蘭大學，醫藥學院，基因組科學研究所
其它作者： Haikel Bogale,Lindsay Rutt,Michael Humphrys,Poonum Korpe,Priya Duggal,Jacques Ravel
導讀
單細胞真核生物和寄生蟲是重要的人類病原體，但缺少方便特異的檢測手段；
本文設計多對18S rRNA基因引物，可以檢測大多數單細胞真核生物和寄生蟲，主要包括頂復門、變形蟲、雙滴蟲、動體目、副基體門、線蟲、扁形動物和微孢子蟲；
使用NCBI數據庫模擬評估擴增產物的長度範圍、分辨率等指標適合Illumina測序，自然樣品評估結果也覆蓋絕大多數目標類群；
本方法是對目前16S擴增子檢測手段的有效補充，有助於提供微生物組更全面的認識。
摘要
背景：幾次人類嚴重疾病是由蚊媒或水和食物汙染傳播的真核寄生蟲引起。這些病原體僅為真核單細胞和寄生蟲很小比例，環境中有很多末知的生物很微小但對健康有普遍的影響。我們對細菌有很好的分子生物學分析工具，甚至真菌；但對大多細單細胞真核和寄生蟲認識很少：檢測這些物種通常靠顯微鏡，無法區分相關物種，分子水平僅能檢測特異病原菌。
結果：我們提出一種16S測序類似的高通量測序方法，可以檢測大範圍的單細胞真核生物和寄生蟲，包括所有人類寄生蟲的物種分類群。我們設計評估了分類群特異的PCR引物，來擴增8個主要類群(頂復亞門Apicomplexa, 變形蟲Amoeba, 雙滴蟲Diplomonadida, 動體目Kinetoplastida, 副基體門Parabasalia, 線蟲Nematoda, 扁形動物Platyhelminthes, 和微孢子Microsporidia)。使用引物篩選臨床、生物和環境樣本的DNA，測序結果分析表明可鑑定己知和末報導的大多數目標分類。
結論：此高通量分析方法可檢測鑑定複雜生物或環境樣本中的真核寄生蟲和相關物種。本方法容易開展，是對現在方法有效的補充，提供微生物組更全面的視角。
主要結果
表1. 引物的特徵和特異性
表1展示了每對引物擴增長度，以及電子評估擴增範圍、信息含量和特異性。電子模擬可擴增的物種(NCBI中公開的物種)數量，DNA序列匹配為單獨的屬或種比例，屬於目標類群的比例。最後兩欄為引物序列。
圖1. 方法流程圖
模式圖展示擴增、添加標籤(barcoding)、混樣和測序的流程。
表2. 生物或環境樣本中單細胞真核和寄生蟲鑑定的示例
每類樣本和每類引物，可擴增多達5個物種匹配DNA序列，與NCBI鑑定比例較一致。當一種DNA序列與多個屬匹配相等時，結果被標明。詳細結果見附表4。
圖2. 重建擴增序列與NCBI中序列的進化樹
a. 鄰接樹展示註釋的變形蟲序列(黑方塊)和人類糞便中擴增的序列(綠鑽)
b. 鄰接樹展示註釋的雙滴蟲序列(黑方塊)、糞便擴增的序列(綠鑽或圓)，和三個波托馬可河樣本中擴增序列(棕色菱形)。
方法
PCR引物設計
我們設計引物擴增人類寄生蟲：頂復亞門Apicomplexa, 變形蟲Amoeba, 酵母菌屬Blastocystis 雙滴蟲Diplomonadida, 動體目Kinetoplastida, 副基體門Parabasalia, 線蟲Nematoda, 扁形動物Platyhelminthes, 和微孢子Microsporidia。為了我們的目的，引物需滿足以下要求：1. 需要擴增目標群體中全部物種，只有很少的非特異擴增；2. 需要鑑定的物種序列有足夠的可區分遺傳信息；3. 擴增產物應該足夠短，可被Illumina測序。
電子評估
基於NCBI公共數據庫相關物種，評估引物的物異性，擴增長度，擴增產物有效性等，參考流程https://github.com/MVesuviusC/2018_methods_paper
主要分析過程：
自然樣本分析
PCR擴增和高通量測序
-
生物信息分析
進化分析
總結
本方法可以獲得樣本中單細胞真核生物和寄生蟲的物種信息，是對現有細菌研究的補充，增加我們對微生物組在人類和動物健康的理解。
熱心腸日報
新引物擴展 18S rRNA 測序檢測範圍
原標題：高通量測序全面檢測生物或環境樣本的單細胞真核生物和寄生蟲
① 單細胞真核生物和寄生蟲是重要的人類病原體，但缺少方便特異的檢測手段；
② 本文設計多對 18S rRNA 基因引物，可以檢測多數單細胞真核生物和寄生蟲，包括頂復動物、變形蟲、酵母、雙滴蟲、動質蟲、線蟲、扁形動物和微孢子蟲等；
③ 使用NCBI數據庫模擬評估擴增產物的長度範圍、分辨率等指標適合Illumina測序，自然樣品評估結果也覆蓋絕大多數目標類群；
④ 本方法是對目前 rRNA 擴增子測序的有效補充，有助於更全面的認識微生物組。
參考文獻
新引物擴展 18S rRNA 測序檢測範圍 https://www.mr-gut.cn/papers/read/1058127404?kf=mobile.search
A high-throughput sequencing assay to comprehensively detect and characterize unicellular eukaryotes and helminths from biological and environmental samples. Microbiome, [9.133] DOI: https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-018-0581-6
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