反向遺傳學是一種不可或缺的工具，它徹底改變了對病毒發病機制和疫苗開發的認識。
目前，人們已經能夠做到利用基因工程對自然界所存在的病毒進行一定程度的改造，使病毒能夠為人所用，甚至“以毒攻毒”，為人類醫療做貢獻。
例如，去年清華大學的研究團隊就在《自然》發表了一篇論文，是將自然界存在的一些致病力較弱的病毒基因改造後製成特殊的溶瘤病毒，能夠選擇性地感染腫瘤細胞，在其內大量複製並最終摧毀腫瘤細胞。
但從頭開始“重建”病毒則是另一個問題。
2002年，美國紐約州立大學石溪分校的科學家僅利用郵購的基因組序列信息和原材料、以及從網上下載的配方，首次在試管中合成出了小兒麻痺症病毒。
由於RNA相對不夠穩定，研究人員利用一些郵購的原料合成出DNA分子後，又用一種酶將其轉錄成小兒麻痺症病毒的RNA。當這些RNA被放入裝有特定化合物和酶的試管中後，它們開始自行復制，最終形成大量病毒。
不過，脊髓灰質炎病毒為20～30納米大小的小核糖核酸病毒，而冠狀病毒則在病毒中屬於“大塊頭”(新冠病毒的大小約為125納米)。所以，人工重組新冠病毒會更加困難。這類大型RNA病毒基因組在大腸桿菌中克隆和操作起來很麻煩，它們體積龐大，而且偶爾會出現不穩定性。
近日，發表在《自然》上的一篇論文“Rapid reconstruction of SARS-CoV-2 using a synthetic genomics platform”展示了一個基於酵母菌的合成基因組學平臺的完整功能，它可以從基因上重建多種RNA病毒，包括冠狀病毒科、黃病毒科和副黏病毒科的成員。
黃病毒屬病毒粒子直徑約為40-50nm，副黏病毒則通常直徑150nm-350nm，也屬於大型病毒。這一研究表明，該平臺也有望用於寨卡病毒、仙台病毒、腮腺炎病毒、黃熱病毒等的人工合成。
論文通訊作者為瑞士伯爾尼大學病毒學與免疫學研究所的Volker Thiel以及該校獸醫學院傳染病與病理生物學學系的Joerg Jores。此前該論文已發表在預印本網站BioRxiv上。
具體而言，研究團隊將病毒基因組分成12個片段，大小在0.5kbp-3.4kbp。為了便於血清學診斷和在細胞培養時追蹤，研究團隊又在其中插入了表達GFP(綠色熒光蛋白)的片段，共計14個片段，交由試劑公司在大腸桿菌中化學克隆合成。
研究團隊利用轉化偶聯重組技術 (TAR)，用酵母菌的同源重組系統依據末端重複的序列，將這些DNA序列拼到一起。獲得完整的病毒序列後，用T7 RNA聚合酶將這一DNA序列轉錄為有感染性的病毒RNA。
隨後，研究團隊將該RNA用電穿孔技術導入到VeroE6(猴腎細胞)中，使得細胞被感染併發出熒光。培養這些細胞的上清液(含釋放出的病毒顆粒)注入到別的培養基中，可以感染別的細胞。
(用於克隆rSARS-CoV-2、rSARS-CoV-2-GFP和synSARS-CoV-2-GFP的SARS-CoV-2基因組組織和DNA片段的示意圖。)
(圖：從酵母克隆1.1、2.2和3.1中提取rSARS-CoV-2，從酵母克隆4.1、5.2和6.2中提取rSARS-CoV2-GFP。)
轉化偶聯重組技術 (TAR)是一種十分成熟的大片段DNA克隆技術，近年來廣泛應用。它是基於含同源序列的DNA片段的自由末端在酵母細胞內能夠高效同源重組的原理而建立。該技術可從複雜基因組中選擇性分離目標DNA，且操作簡便，實驗週期短。
20世紀80年代，科學家首次證明在酵母細胞內兩個含同源序列的DNA分子可以同源重組，並將其開發用於更普遍的DNA體內連接或拼接，後被命名為TAR克隆技術。
除了新冠病毒以外，研究團隊還給出了對其他34種RNA病毒全合成的技術細節。
研究人員表示，基於這個平臺，能夠在收到合成的DNA片段後的一週內，對最近流行的SARS-CoV-2病毒設計進行化學合成克隆，並使其復活。這一過程無需從病人樣本中提取完整病毒。
在傳染病迅速散播開來的情況下，在一週之內大量人工生產出有活性的病毒，將有利於科學界對新出現的病毒做出快速反應，在暴發期間實時地生成和描述進化的RNA病毒變種的功能，為研究掃清障礙，同時也能依據需求改造出實驗所需的病毒工具。
https://www.nature.com/articles/s41586-020-2294-9
http://news.bioon.com/article/6746553.html
http://tech.sina.com.cn/o/2002-07-13/125845.shtml
https://max.book118.com/html/2018/0731/6222140155001210.shtm
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