導讀
阿爾茨海默病(AD)的特點是β-澱粉樣蛋白(Aβ)和過度磷酸化的tau蛋白在腦內瀰漫性累積以及突觸功能障礙。此外，正如AD患者小膠質細胞和星形膠質細胞激活所示，大腦內炎症信號發生了改變。這些特徵會引起認知障礙和記憶喪失。雖然阿爾茨海默病的神經病理學特徵已得到充分證實，但目前尚無有效的治療方法能夠阻止或延緩阿爾茨海默病的進展。因此，我們需要基於各種病理通路來探索治療AD的新方法。腸道微生物群被認為是一種被遺忘的調節宿主生理和新陳代謝的因素，且其功能已經延伸到大腦發育和認知功能。在帕金森病和肌萎縮性脊髓側索硬化症中報道了腸道微生物群可能與神經變性疾病有關。在轉基因AD模型和患者的微生物組研究中，我們試圖完善AD的發病機理並以不同的方式去表徵其病理。在AD小鼠模型和患者中均發現了腸道微生物群的組成和生物多樣性的改變。抗生素治療的APP/PS1小鼠(ABX)和益生菌治療的3×TgAD小鼠顯示出大腦Aβ沉積明顯降低以及外周循環細胞因子、趨化因子和腸道激素等模式發生改變。而且，將改變後的微生物群移植到無菌的APP-轉基因小鼠中，可表現出相同的Aβ沉積病理特徵，這種可傳遞性表明腸道微生物群在AD早期發揮了作用。但是，目前腸道微生物群的遠端效應在AD發病機理的特異性信號介質或者機理尚不清楚。
本研究利用近期開發的轉基因AD小鼠模型(ADLPAPT)--具有澱粉樣變性和神經纖維結的AD樣病理組織（即在大腦中同時具有Aβ和TAU蛋白病體特徵），檢測了腸道微生物群在AD發病機理中的作用。我們發現腸道微生物群的改變和上皮屏障完整性的缺失在ADLPAPT小鼠的病理條件下誘導發生全身慢性炎症。值得注意的是，從健康的野生型(WT)小鼠中頻繁轉移和移植糞便微生物組可以減少Aβ斑塊和tau分裂的形成，以及ADLPAPT小鼠的記憶缺失和反應性膠質變性。此外，腸道微生物群的改變影響了腸道基因的表達和外周免疫細胞群。研究結果揭示了腸道微生物群在AD發病機制中的重要作用，表明了異常的免疫應答可能是宿主腦和腸道微生物群遠距離作用的潛在調節因子。
論文ID
原名：Transferof a healthy microbiota reduces amyloid and tau pathology in an Alzheimer’sdisease animal model
譯名：在阿爾茨海默病動物模型中健康微生物群的轉移可減少澱粉樣蛋白和tau蛋白病理學
期刊：Gut
IF：9.86
發表時間：17.94
通訊作者：Jin-WooBae；Inhee Mook-Jung
作者單位：慶熙大學生命與納米藥物科學系和生物系；首爾國立大學醫學院生物化學與生物醫學系
實驗設計
本研究利用近期開發的轉基因AD小鼠模型(ADLPAPT)--具有澱粉樣變性和神經纖維結的AD樣病理組織（即在大腦中同時具有Aβ和TAU蛋白病體特徵），檢測了腸道微生物群在AD發病機理中的作用。
結果
1 ADLPAPT小鼠的腸道微生物群在群落水平的改變
為了檢測AD患者腦內神經病理學變化是否與腸道微生物群有關，我們研究了8個月齡ADLPAPT小鼠的腸道微生物群組成，此時開始出現嚴重的Aβ沉積和tau蛋白。使用454對16S rRNA基因擴增子進行焦磷酸測序，在Bray-Curtis（OTU丰度）和Jaccard（OTU發生）的基礎上，通過主座標分析對WT和ADLPAPT小鼠之間的腸道菌群基於生物分類單位（OTU）進行比較。根據OUT級細菌種類的發生率和豐度（圖1A，B），將ADLPAPT小鼠的腸道菌群與WT小鼠出現差異，表明ADLPAPT小鼠腸道微生物群發生改變。
圖1AB ADLPAPT小鼠腸道微生物群組成的變化
2 ADLPAPT小鼠模型的慢性低水平腸道和全身炎症以及腸道的高滲透性
為了確定ADLPAPT小鼠腸道菌群改變對腸屏障功能的影響，我們通過異硫氰酸熒光素（FITC）-葡聚糖方法測量了WT和ADLPAPT小鼠的腸道通透性。我們發現ADLPAPT小鼠的FITC-右旋糖酐血清濃度顯著高於WT小鼠，表明ADLPAPT小鼠的腸道通透性增加（圖1C）。我們測量了WT和ADLPAPT小鼠的糞便白蛋白水平，但未觀察到差異（圖1D），這表明ADLPAPT小鼠的高腸通透性可能不歸因於細胞損傷。此外，與野生型小鼠相比，ADLPAPT小鼠表現出反映腸道炎症的糞便脂質鈣蛋白2濃度高（圖1E），這表明ADLPAPT腸存在慢性低度炎症。ADLPAPT小鼠腸屏障完整性的缺失可能使血流從腸腔通過門靜脈流向周圍器官。在這方面，我們測量了血清脂多糖結合蛋白（LBP）的水平，作為引起系統性炎症的微生物群衍生化合物進行系統性傳播的標誌。我們發現ADLPAPT小鼠的血清LBP水平高於WT小鼠（圖1F），表明可能是全身性炎症由腸道微生物群來源的抗原（包括脂多糖（LPS））流入ADLPAPT小鼠的循環系統引起的。總之，以上結果證明來自ADLPAPT小鼠腸道微生物群改變的微生物成分（例如LPS）可能通過可滲透的腸道屏障促進了AD發病。
圖1C-F ADLPAPT小鼠高腸道通透性以及腸道和全身炎症
3 糞便微生物群的頻繁轉移減輕了ADLPAPT小鼠的認知障礙，Aβ斑塊負擔，tau病理和反應性神經膠質的活性
為了闡明腸道菌群改變對AD發病機制的影響，我們幾乎每天將WT小鼠的糞便材料轉移至ADLPAPT小鼠，共持續4個月（FMT）（圖2A）。FMT在很大程度上影響了ADLPAPT小鼠的腸道菌群。FMT小鼠（4個月大的小鼠）2個月後，腸道微生物群落組成發生了顯著變化；最後，它與FMT 4個月後（6個月大的小鼠）的WT和ADLPAPT小鼠的菌群相似。我們進行了兩項行為測試，以評估空間學習和記憶功能。在Y迷宮中，與ADLPAPT小鼠相比，FMT小鼠的空間短期記憶障礙得到了明顯緩解，總體無顯著差異（圖2B，C）。接下來，我們在情境恐懼條件分析中評估了FMT小鼠。恐懼條件測試中的所有組在足部電擊後均表現出相似的凍結行為（圖2D–G），而FMT小鼠在情境測試中表現出長期記憶障礙改善的趨勢（圖2E，H）。這些數據表明，持續暴露於健康的腸道菌群可能會改善ADLPAPT小鼠的認知功能受損。
圖2 FMT後ADLPAPT小鼠的記憶缺陷得到改善
為了確定健康的腸道菌群對Aβ斑塊沉積的影響，我們檢測了ADLPAPT小鼠的Aβ斑塊負擔。與ADLPAPT小鼠相比，FMT小鼠的額葉皮層（圖3A，B）和海馬（圖3G，H）的總斑塊面積明顯較小。此外，ELISA分析表明，與ADLPAPT小鼠相比，FMT小鼠的大腦皮層中可溶和不可溶Aβ40水平均顯著降低（圖3C，D）。此外，FMT小鼠表現出改善Aβ42聚集的趨勢（圖3E，F）。
圖3 FMT後ADLPAPT小鼠的Aβ斑塊負擔降低
接下來，我們發現FMT誘導的腸道菌群變化降低了ADLPAPT小鼠海馬中的病理性tau聚集體（圖4A，B）。使用AT180（Thr231位點的高磷酸化代表tau病理的早期事件）和AT8（Ser202/ Thr205位點的高磷酸化代表tau病理的中期或晚期）抗體，我們發現在FMT後的ADLPAPT小鼠中檢測到成對的螺旋狀絲狀tau螺旋AT180和AT8均顯著降低（圖4C–F）。這些結果表明，暴露於健康的腸道菌群可以削弱大腦中的Aβ沉積和tau病理。
圖4 FMT後ADLPAPT小鼠海馬中tau的聚集減少
由於中樞神經系統（CNS）的神經膠質增生是AD公認的病理特徵，因此我們用離子化鈣結合適配器分子（Iba1）染色鑑定了活化小膠質細胞和用神經膠質纖維酸性蛋白（GFAP）染色的肥大反應性星形膠質細胞。與ADLPAPT小鼠相比，FMT小鼠額葉皮層中Iba1陽性的小膠質細胞和GFAP陽性星形膠質細胞（圖5A–C）顯著減少，表明神經膠質沉著症通過移植健康腸道菌群而減弱，進而可能降低ADLPAPT小鼠大腦中的免疫病理反應。
圖5 FMT後抑制ADLPAPT小鼠小膠質細胞增生和星形膠質細胞增生
4 微生物菌群移植改善了ABX治療的ADLPAPT小鼠的行為障礙，Aβ斑塊負擔，tau病理和神經膠質活化
為了進一步闡明微生物群可以抑制AD的病理學進展，我們將WT或ADLPAPT小鼠的糞便微生物群移植到接受了五種ABX預處理的受體ADLPAPT小鼠中。首先，我們確認ABX有效抑制了微生物活性，但是未觀察到Aβ斑塊沉積，tau結節形成和神經膠質變性等變化。WT小鼠糞便微生物菌群的移植改變了ABX處理的ADLPAPT小鼠的腸道菌群的組成。將兩組接受ABX處理的ADLPAPT小鼠的腸道菌群與供體小鼠的腸道菌群相互分離出來。有趣的是，與WT微生物菌群移植的ABX處理的ADLPAPT小鼠相比，經ADLPAPT菌群移植的ABX處理的ADLPAPT小鼠表現出更高的腸道通透性。WT菌群的移植改善了ABX治療的ADLPAPT小鼠的多動症。
接下來，我們測試了糞便微生物群移植是否會影響大腦中的AD發病機理。供體ADLPAPT小鼠和經ADLPAPT微生物菌群移植的ABX治療的ADLPAPT小鼠顯示出相似程度的Aβ斑塊，而WT微生物群移植延緩了Aβ斑塊在ABX處理的ADLPAPT小鼠額葉皮層中的沉積。WT微生物群移植後，在ABX處理的ADLPAPT小鼠中觀察到AT180檢測到的tau降低和AT8檢測到tau有降低趨勢，但未在ADLPAPT菌群移植後的小鼠中觀察到該現象。此外，在接受WT或ADLPAPT菌群的ABX治療的ADLPAPT小鼠之間觀察到了神經膠質細胞的差異。結合ABX處理的ADLPAPT小鼠的結果表明，重建健康的腸道菌群可以緩解ADLPAPT小鼠的腸屏障完整性和大腦內AD病變。
5 FMT逆轉ADLPAPT小鼠中與組織變性和腸道巨噬細胞活性相關的結腸轉錄變化
為了闡明ADLPAPT小鼠中FMT誘導的AD相關病理學逆轉的腸道相關機制，我們對6個月大的WT、ADLPAPT和FMT小鼠的結腸組織進行了RNA-Seq分析。因此，獲得了每隻小鼠3.1±0.3Gb（平均值±SD）的高質量讀數，產生了19257±115個基因分配。通過對結腸轉錄組數據的差異表達分析，如果基因表達水平顯著高於野生型小鼠，則認為其在ADLPAPT小鼠中表達上調。如果基因表達水平顯著低於野生型小鼠，則認為ADLPAPT小鼠中的基因被下調（在線補充圖10A，B）。因此，與WT小鼠相比，我們在ADLPAPT小鼠中發現了78個上調基因和136個下調基因（圖6A），表明ADLPAPT小鼠的結腸轉錄組發生了改變。為了弄清楚FMT處理如何影響ADLPAPT的結腸轉錄組，我們通過比較FMT小鼠和WT小鼠的基因表達水平來跟蹤上調和下調基因的變化。在ADLPAPT小鼠中上調的78個基因中，我們發現FMT小鼠中60個基因的表達沒有顯著差異。對於136個下調的基因，有83個基因在ADLPAPT和FMT小鼠之間沒有顯著差異（圖6B），這表明大多數表達水平改變的結腸基因已被FMT歸一化。根據差異（DE）基因的表達水平，FMT小鼠更接近WT小鼠（圖6C）。
通過基因本體分析，我們發現ADLPAPT小鼠的DE基因改變與衰老相關的組織變性和粘膜免疫力下降有關（圖6D）。具體而言，在ADLPAPT小鼠中上調的基因有助於降低細胞增殖，細胞衰老和細胞生長停滯，這是與衰老相關的典型特徵。ADLPAPT小鼠線粒體和核糖體活性相關基因的下調可能導致ATP合成和蛋白質合成異常，這被認為是衰老和神經退行性疾病的關鍵特徵。此外，ADLPAPT小鼠顯示出與粘膜免疫反應有關的基因下調。其中與腸道巨噬細胞活性和單核細胞-巨噬細胞軸有關。在腸中，通過循環血液Ly6Chi單核細胞不斷補充的腸巨噬細胞有助於腸道穩態，包括組織穩態。因此，對結腸轉錄組的比較分析表明，FMT可逆轉ADLPAPT小鼠的腸道相關異常，例如衰老引起的組織變性和巨噬細胞介導的免疫功能障礙。
圖6 FMT後ADLPAPT小鼠結腸基因表達改變的逆轉
6 FMT將ADLPAPT小鼠中Ly6G-Ly6C + CD115 +骨髓細胞的超大種群恢復到WT水平
為了確定與FMT感染ADLPAPT小鼠的AD病理學相關的血液免疫細胞群，我們比較了WT，ADLPAPT和FMT小鼠外周血白細胞（PBL）的概況。因為結腸轉錄組數據顯示與腸巨噬細胞相關的基因表達改變，所以我們集中研究CD11c-CD11b+髓樣細胞的變化。在流式細胞儀分析中，根據疾病嚴重程度的變化，檢測到CD11c-CD11b+Ly6G-Ly6C+CD115+炎性單核細胞的部分變化。實際上，在ADLPAPT小鼠的PBL中，炎性單核細胞的比例（平均為63.87％）顯著高於WT小鼠（平均為42.28％）或FMT小鼠（平均為39.94％）（圖7A，B），提示炎症性單核細胞與ADLPAPT小鼠的疾病嚴重程度成正相關。以上數據表明腸道菌群相關的信號可能參與ADLPAPT小鼠大腦中的AD發病，其中循環的炎性單核細胞可以促進細胞介導。
圖7 FMT誘導外周免疫細胞群的改變
討論
本研究旨在探究腸道微生物群對AD發病機制的潛在影響。結果表明，在ADLPAPT小鼠生命早期，腸道菌群組成的改變會引起慢性腸道炎症和上皮完整性的缺失，從而導致全身性炎症。這些腸道異常表現與ADLPAPT小鼠的Aβ沉積、tau病理、反應性神經膠質增生和認知障礙同時發生，且似乎與單核細胞募集和腸道巨噬細胞功能障礙密切相關。值得注意的是，ADLPAPT小鼠以上病理特徵可以通過正常微生物群的頻繁轉移或者移植來有效改善。因此，我們的發現支持腸-腦雙向交流影響AD神經病理學進展的觀點。
在ADLPAPT小鼠和WT小鼠生命早期（在2個月大時），其腸道菌群組成就開始出現差異，這種差異在老年小鼠中愈加明顯，這表明腸道菌群的改變可歸因於轉基因修飾。AD轉基因誘導的微生物群變化未達到全科或門類水平的變化，在ADLPAPT小鼠中幾乎沒有檢測到特異性的細菌分類。以上結果表明，腸-腦軸的複雜信號級聯雖對腸道微生物群有一定影響，但不是決定性因素。這些也指出了菌群生態學，微生物-微生物相互作用或微生物功能對AD發病的重要性（而不是單一細菌分類群的重要性）。值得注意的是，FMT似乎可以改善ADLPAPT小鼠的澱粉樣變性，tau病理，反應性神經膠質增生和認知障礙。Minter等人使用ABX混合物抑制APP/PS1小鼠的微生物活性，而Bonfili等人在3xTg AD小鼠中測試了益生菌混合物。最近，Sun等人將野生型小鼠的糞便處理成APP/PS1小鼠。儘管如此，在數只AD模型小鼠中對腸道菌群進行不同干預對其病理生理特徵具有相似的影響，這至少表明腸道微生物失衡可以促進AD。
ADLPAPT小鼠的結腸基因表達模式也不同於WT小鼠，其中許多基因參與單核細胞趨化性和巨噬細胞激活的炎症反應。已發現，定植在腸道的巨噬細胞對於啟動微生物監測的免疫反應至關重要,並在清除凋亡或衰老細胞以及上皮完整性和功能上起著主要作用。隨著循環的Ly6Chi單核細胞局部成熟進入腸道，巨噬細胞，單核細胞的補充（例如CC基序趨化因子配體2–CC趨化因子受體2（CCL2–CCR2軸））是維持腸道巨噬細胞的重要過程。因此與趨化因子介導的單核細胞募集有關的基因的下調可能導致單核細胞的補充不完全，從而導致ADLPAPT小鼠腸道巨噬細胞不足。在這方面，干擾素-γ信號的下調和巨噬細胞活化的細胞外信號調節的激酶信號通路可能歸因於ADLPAPT小鼠腸道免疫和上皮穩態的干擾。有趣的是，大多數ADLPAPT小鼠特異性改變的DE基因通過FMT恢復至幾乎正常表達；這些巨噬細胞介導的變化可能進一步通過循環Ly6C +單核細胞抑制ADLPAPT小鼠的腦澱粉樣變性，tau病理，反應性神經膠質增生和認知缺陷。
這些與腸道相關的變化可能共同導致ADLPAPT小鼠腸屏障通透性的增加和腸道慢性炎症，這些被認為是AD的潛在危險因素。為了確定Aβ相關和tau相關神經變性對腸屏障功能的不同貢獻，我們還分別評估了僅表達Aβ病理（ADLPAPT/ PS1小鼠）或tau病理（ADLPTau小鼠）ADLP小鼠的腸道通透性。已在老年人、高齡小鼠和果蠅中觀察到微生物群相關的腸屏障功能障礙，並被認為是與衰老相關的慢性低度全身性炎症的觸發因素。根據結腸轉錄組數據和糞便白蛋白水平，ADLPAPT小鼠的腸屏障功能障礙的特徵可能是上皮細胞衰老和巨噬細胞介導的屏障完整性功能障礙，而不是腸道腸上皮層細胞受損。這些發現與Thevaranjan等人的結果相似，表明老年小鼠的腸道滲漏是由於細胞旁通透性引起的。此外，腸道免疫反應本身的持續異常會觸發微生物失衡，從而導致慢性炎症的惡性循環。鑑於腸道通透性先於全身性炎症，微生物源性化合物從腸道向血液循環的轉移是全身性炎症的強大驅動力，隨後會隨年齡的增長而介導組織損傷。實際上，ADLPAPT小鼠表現出較高的血清LBP濃度，FMT使炎症性單核細胞水平恢復至與WT小鼠接近，這提示ADLPAPT小鼠全身暴露於腸道相關細菌內毒素，如LPS。考慮到循環中的微生物內毒素通過誘導單核細胞從骨髓中遷移而增加了循環中的單核細胞，ADLPAPT小鼠的代謝性內毒素血癥可能為Ly6C+炎性單核細胞循環進入血液提供了機會。外周炎性單核細胞的增加可通過直接滲透到大腦或向大腦產生信號分子來影響AD發病。因此，AD中循環單核細胞在大腦中的作用仍有待進一步研究。
腸道通透性高會破壞血腦屏障，而中樞神經系統很容易暴露於改變的腸道菌群中。在AD患者腦內發現的LPS參與AD病理。LPS和Aβ肽的體外孵育可增強Aβ的原纖維形成，細菌LPS的體內注射會導致WT小鼠和轉基因AD小鼠模型出現認知缺陷，並在海馬中形成Aβ沉積物和tau聚集。另外，在AD患者的死後腦組織中觀察到LPS與Aβ斑塊共定位。考慮到已經描述了Aβ表達對腦部微生物感染具有抗微生物活性，因此可滲透的腸屏障和隨後的全身炎症可能是ADLPAPT小鼠中Aβ斑塊負擔的原因。根據最近的研究揭示，5xFAD小鼠在小膠質細胞的耐受期失去了吞噬功能，預期微生物源性代謝產物和/或細菌的慢性轉移進入循環會導致ADLPAPT小鼠小膠質細胞的代謝缺陷。
最近，FMT在諸如艱難梭菌感染，IBD和自閉症等疾病的治療方面受到了廣泛關注。在這項研究中，我們首先檢查了FMT對AD小鼠模型中Aβ和tau病理的影響。值得注意的是，用健康的腸道菌群替代菌群可以減輕大腦中的Aβ，tau和反應性神經膠質病理（圖7C）。因此，我們提出AD中異常的全身性因素可能是該疾病的新治療靶標，調控包括微生物群的外圍系統可以為AD發病機理提供新觀點。
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