導讀
對於克羅恩病患者來說，迴腸切除術後復發十分頻繁。儘管目前已經確定了復發的幾種臨床風險因素，但是其預測效果仍十分有限。目前比較推薦手術後第一年進行迴腸結腸鏡檢查從而評估內窺鏡複發率並及時調整治療方案。
本研究利用手術時和內窺鏡評估時採集的迴腸樣本，利用16S測序數據及兩種不同的分析方法評估了迴腸粘膜相關菌群在克羅恩病術後內窺鏡復發預測中的作用，對於克羅恩病患者的術後治療具有指導意義。
論文ID
原名：Prominence of ileal mucosa-associated microbiotato predict post operative endoscopic recurrence in Crohn's disease
譯名：迴腸粘膜相關菌群在克羅恩病術後內鏡復發預測中的作用
期刊：Gut
IF：17.943
發表時間：2020.5.29
作者單位：法國巴黎聖安託萬醫院消化內科
實驗設計
本研究針對在法國招募的201名患者分別在手術時（M0）和內窺鏡評估（M6）時採集迴腸樣本，並對這些樣本進行基因提取和16S DNA測序從而進行細菌菌群分析。研究者對於獲得的16S序列數據進行多樣性分析，並利用邏輯迴歸模型和隨機森林模型等進行統計分析，從而評估與迴腸粘膜相關微生物群對克羅恩病術後內窺鏡復發的預測情況。
結果
1 研究群體的特徵
基於先前描述的2010年9月1日至2017年9月30日之間的289名患者，研究者從其中215名患者中採集了手術（M0）和/或內窺鏡評估（M6）時的迴腸活檢組織。經過16S測序數據的質量控制檢查，排除了14個樣本，最終分析了201名患者的288個樣本。表1中詳細列出了他們的人口統計學和臨床特徵。
2 術後粘膜相關微生物群的變化
該研究群體主要由難治患者組成，因為其中有一半在手術前接受了抗腫瘤壞死因子（TNF）藥物的治療，有五分之一曾接受過腸切除術。術後約有三分之一的患者接受抗TNF藥物治療。該研究群體在術後內窺鏡復發（Rutgeerts評分i2-i4）或不復發（Rutgeerts評分i0-i1）的患者之間有一個良好的平衡。有87名患者在M0和M6時期均提供了樣本。
為了評估手術後迴腸粘膜相關微生物群的變化，研究者首先關注了在M0和M6時期均提供樣本的87名患者。β多樣性的分析顯示，將樣本根據時間點彙集在一起時，M0和M6時期的樣本之間具有統計學顯著差異（圖1A）。當進行全局分析時，由Shannon指數和Chao1指數評估的α多樣性在M0和M6之間並沒有顯著差異。但是，將患者根據M6時期內窺鏡復發情況進行分組時，研究者在內窺鏡復發患者（i2-i4）中觀察到其α多樣性出現統計學意義的降低，而在其他組患者（i0-i1）中並未觀察到（圖1B-C）。
圖1. M0和M6之間粘膜相關微生物群的演化。（A）β多樣性。Bray-Curtis距離的主座標分析，並且每一個樣本顏色根據疾病表型而定。PC1、PC2和PC3代表捕獲大部分多樣性的前三個主座標。座標捕獲的多樣性分數以百分比的形式給出。使用相似性分析的方法比較各個組。在內窺鏡不復發患者（i0-i1）（B）和內窺鏡復發患者（i2-i4）（C）（威氏配對符號秩次檢驗）中，使用Shannon指數和Chao1指數描述α多樣性。（D）細菌微生物群在門和科水平上的總體組成。患者的亞組標記在x軸上。M0：手術時採集的樣本；M6：內窺鏡檢測時採集的樣本。
根據先前發表的研究，迴腸粘膜相關微生物群主要是來自厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和變形菌門以及Ruminococcaceae、Lachnospiraceae、Veillonellaceae、Enterobacteriaceae、Burkholderiaceae和Bifidobacteriaceae等細菌（圖1D）。接著，研究者根據M6時期內窺鏡復發情況，使用LEfSe分析鑑定了在M0和M6之間差異表現的細菌分類群（圖2）。對於變形菌門，包括克雷伯氏肺炎桿菌在內的幾種屬於γ-變形菌綱的類群在手術後減少了。然而，對於內窺鏡復發和不復發的患者，其屬於α-變形菌綱的許多分類群都在M6時期增加了，但是內窺鏡復發患者中的信號更強，並且其體內來自α-變形菌綱的細菌出現總體增加。對於放線菌門，內窺鏡不復發患者體內屬於放線菌屬的細菌在M6時期有序減少的幅度比內窺鏡復發患者體內減少幅度更大。對於厚壁菌門，內窺鏡不復發患者體內來自梭菌目的細菌（尤其是Lachnospiraceae和Ruminococcaceae，包括Roseburia、Blautia和Dorea等菌屬）在M6時期有序增加的幅度比內窺鏡復發患者的更大。相比之下，芽孢桿菌的成員（例如Streptococcus和Enterococcus）在M6時期增加。
圖2. 根據術後內窺鏡復發情況，細菌類群在M0和M6時期之間的差異表現。M0和M6之間具有顯著差異（LDA評分＞2.5）的細菌類群被表示出來。條形圖的輪廓顏色表示M6時期細菌類群是增加的（紅色，圖的左半部分）還是減少的（綠色，圖的右半部分）。條形圖的顏色表示在內窺鏡不復發患者（i0-i1，藍色）或內窺鏡復發患者（i2-i4，橙色）中細菌類群發生的改變。內圈表示細菌類群所屬的門。M0：手術時採集的樣本；M6：內窺鏡檢測時採集的樣本。LDA：線性判別分析。
綜上所述，這些結果證明了克羅恩病（CD）患者手術後迴腸粘膜相關的微生物群發生了深刻變化。這些變化往往會減弱與迴腸CD相關的菌群失調，例如α-變形菌綱的繁殖以及Lachnospiraceae和Ruminococcaceae等菌屬的減少，但這種菌群失調減弱現象在內窺鏡復發患者中比較弱。
3 術後內窺鏡復發患者體內迴腸粘膜相關微生物群的改變
接著，研究者將重點放在術後內窺鏡評估（M6）期間獲得的135個樣本上，從而調查與內窺鏡復發相關的細菌分類群。β多樣性分析顯示，來自內窺鏡復發患者（i2-i4）與不復發患者（i0-i1）的樣本之間具有統計學顯著差異（圖3A），但具有臨床疾病活動度患者（Harvey-Bradshaw指數，HBI≥4）或沒有臨床疾病活動度患者（Harvey-Bradshaw指數，HBI＜4）之間沒有顯著差異。同樣，由Shannon指數評估的α多樣性在內窺鏡復發患者體內更低（圖3B），然而其在有/沒有臨床疾病活動度患者之間沒有差異。微生物群組成的變化與Rutgeerts指數同時增加，這是由於來自變形菌門細菌的擴增和來自厚壁菌門細菌的減少（圖3C）。接著，研究者使用LEfSe分析鑑定了在M6時期內窺鏡復發/不復發患者之間差異表現的細菌分類群（圖3D）。在內窺鏡復發患者中觀察到變形菌門（尤其是α-變形桿菌）以及棒桿菌科、腸球菌屬的增加。類似的，與內窺鏡不復發患者相比，內窺鏡復發患者中觀察到厚壁菌門中幾個成員（尤其是Lachnospiraceae和Ruminococcaceae等菌科，包括Eubacterium、Ruminococcus、Butyricoccus、Dorea和Blautia等菌屬）的減少。
圖3. 術後內窺鏡復發患者中細菌腸道微生物群的改變。（A）β多樣性。Bray-Curtis距離的主座標分析，並且每一個樣本顏色根據疾病表型而定。PC1、PC2和PC3代表捕獲大部分多樣性的前三個主座標。座標捕獲的多樣性分數以百分比的形式給出。使用相似性分析的方法比較各個組。（B）所示組中α多樣性的Shannon指數（Mann-Whitney檢驗）。（C）細菌微生物群在門和科水平上的總體組成。患者的亞組標記在x軸上，並表示為每組的相對處理分類單位丰度。（D）在術後內窺鏡復發患者（i2-i4）和不復發患者（i0-i1）中細菌類群的差異表現，根據LDA（LDA評分＞2）顯示具有顯著的統計學水平的差異。LDA：線性判別分析; M0：手術時採集的樣本；M6：內窺鏡檢測時採集的樣本。
綜上所述，這些結果表明，與內窺鏡不復發患者相比，內窺鏡復發患者體內與迴腸粘膜相關的微生物群表現出強烈地變化。與健康受試者相比，這些變化與迴腸CD中普遍觀察到的變化非常相似，即α多樣性降低，變形菌門中幾個成員增加，而厚壁菌門中Lachnospiraceae和Ruminococcaceae等菌科的一些成員減少。
4 迴腸粘膜相關微生物群在手術中作為術後內窺鏡復發的預測指標
然後，研究者尋找手術中腸道菌群作為術後內窺鏡復發預測指標的作用。為此，研究者考慮了在手術時（M0）採集的153份樣本。如果腸道菌群具有預測作用，那麼術前使用抗生素很可能掩蓋它。的確，研究者證實了手術前一個月施用抗生素對微生物群具有顯著影響，其β多樣性發生了顯著變化（圖4A），由Shannon指數和Chao1指數評估的α多樣性降低了（圖4B），並且在損害厚壁菌門細菌數量的情況下變形菌門細菌增加了（圖4C）。因此，研究者排除了在手術前一個月接受過抗生素治療的患者後，再進行下一步的分析。由於施用抗-TNF一個有效防止復發的術後治療手段，且其在該研究群體已確定與症狀緩解的維持有關，因此，研究者在尋找能夠預測內窺鏡復發的細菌類群過程中將該參數考慮在內。M0時期的α多樣性並不能區分M6時有無內窺鏡復發患者。因此，研究者利用LEfSe分析了一個特定人群（該特定人群不包括術後接受抗-TNF治療的患者），從而鑑定M6時期內窺鏡復發和不復發患者之間在M0時期差異表現的細菌類群（圖4D，E）。在已鑑定的細菌類群中，Acetobacteriaceae、賴氏菌和鏈球菌的丰度與棒桿菌的丰度高度相關，因此將它們排除之後再進行下一步分析。接著，研究者進行了邏輯迴歸分析，同時將先前確定的預測內窺鏡復發的臨床因素（例如男性、主動吸菸和先前接受過腸切除術）考慮在內。如表2所示，γ-變形菌綱、Ruminiclostridium 6和Ruminococcus gnavus group.Other與內窺鏡復發存在顯著相關性。
圖4. 根據術後內窺鏡復發情況M0時期的細菌腸道微生物群。（A）β多樣性。Bray-Curtis距離的主座標分析，並且每一個樣本顏色根據手術前最後一個月抗生素的攝入而定。PC1、PC2和PC3代表捕獲大部分多樣性的前三個主座標。座標捕獲的多樣性分數以百分比的形式給出。使用相似性分析的方法比較各個組。（B）所示組中α多樣性的Shannon指數和Chao1指數（Mann-Whitney檢驗）。手術前最後一個月是否有抗生素攝入的患者（C）和根據術後內窺鏡復發情況（D）患者中細菌微生物群在門和科水平上的總體組成。患者的亞組標記在x軸上，並表示為每組的相對處理分類單位丰度。（E）接受（i2-i4）或不接受（i0-i1）術後內窺鏡復發的患者在M0時期細菌類群的差異表現，根據LDA（LDA評分＞2）顯示具有顯著的統計學水平的差異。對於（D）和（E），在手術前一個月接受抗生素治療或術後接受抗-TNF治療的患者都排除在外。LDA：線性判別分析; M0：手術時採集的樣本；M6：內窺鏡檢測時採集的樣本。
最後，研究者將術後接受抗-TNF治療的患者加進來重新進行了分析，並在分析模型中添加術後接受抗-TNF治療作為新的參數。結果發現γ-變形菌綱和R. gnavus group的趨勢仍然存在，但不具有統計學意義。同時證實了高丰度的Ruminiclostridium 6具有保護作用，而高丰度的棒桿菌屬有害。接著，在相同的研究群體中，研究者將這兩個重要的細菌類群和先前確定的每個臨床風險因素（包括手術期間吸菸、男性以及先前接受過腸切除術）都考慮在內後進行了評分。在術後未接受抗-TNF治療的患者中，該評分與內窺鏡複發率的相關性良好，即風險係數分別為0-1，2和＞2的患者中，其Rutgeerts評分≥i2的概率分別為14%，53%和86%（圖5A）。而在術後接受抗-TNF治療的患者中，該評分對內窺鏡復發的預測情況要差一點，這表明術後服用抗-TNF藥物會影響自然病程。隨後，研究者將術後接受抗-TNF治療的患者納入分析，並將這種治療措施視為評分過程中的保護因素。在這種情況下，該評分與內窺鏡復發的相關性良好，即風險係數分別為0-1，2，3和＞3的患者中，其Rutgeerts評分≥i2的概率分別為18%，30%，53%和81%（圖5B）。
圖5. 根據風險因素的數目，對於術後未接受抗腫瘤壞死因子（TNF）藥物治療的患者（A）和接受或未接受術後抗TNF藥物治療的患者在M0時期的細菌腸道微生物群可以作為術後內窺鏡復發Rutgeerts評分的預測指標。考慮在內的風險因素包括手術期間吸菸、男性、先前接受過腸切除術等。對於隨機森林模型的曲線下面積，考慮微生物群因素時存在不包括（C）或包括（D）臨床因素的情況。結果展示了訓練組（感興趣群體的70%）、驗證組（剩下的30%）和整個研究群體的情況。該分析排除了手術前最後一個月接受抗生素治療的患者。AUC：曲線下面積；ROC：曲線。
最終，研究者使用隨機森林法將腸道菌群（圖4E鑑定的細菌類群）同時包括/不包括先前確定的臨床風險因素考慮在內，從而預測內窺鏡復發。為此，研究者將感興趣的研究群體分為訓練組（感興趣研究群體的70%，隨機選擇）和驗證組（剩下的30%）。ROC曲線顯示出感興趣的曲線下面積（AUC）的81%（60.8%-100%）（圖5C）。在隨機森林模型中，最具有提示信息的分離群是鏈球菌屬、R._gnavus group.Other和γ-變形菌綱。在模型中將臨床因素添加到感興趣的腸道菌群中並不能出現改善，即驗證組中AUC的78.6%（56%-100%）（圖5D）。根據先前的結果，這些模型預測對於術後接受抗-TNF治療的患者無效。綜合考慮這些結果表明，手術過程中的腸道菌群可能是內窺鏡復發的預測因素，並且可以用來指導治療。此外，術後接受抗-TNF治療似乎可以改變自然病程和內窺鏡復發的風險。
討論
在本文中，研究者發現迴腸粘膜相關的腸道菌群在CD患者手術後表現出深刻變化，與不復發的情況相比，內窺鏡復發與迴腸粘膜相關菌群的強烈差異相關。使用兩種不同的方法，研究者顯示手術過程中的腸道菌群可能是內窺鏡復發的預測因素。
儘管先前的研究比較關注外科手術對CD患者腸道菌群的影響，但迄今為止，本研究是最大且唯一的一個研究迴腸粘膜相關菌群而不是糞便微生物。在M0和M6時間點之間，研究者觀察到微生物群組成的變化。除了在病情惡化和緩解CD患者之間觀察到的厚壁菌門和變形菌門相對比例的經典變化外，研究者還觀察到每個菌門內的變化。在變形菌門內，γ-變形菌綱類群在M0和M6之間減少，而α-變形菌綱類群則出現相反變化。在厚壁菌門內，芽孢桿菌類群在M0和M6之間減少，而梭菌目出現有序增加。有趣的是，與內窺鏡復發患者相比，梭菌目以及Lachnospiraceae和Ruminococcaceae等菌科（包括Roseburia、Blautia和Dorea等菌屬）的增加（被認為與腸道健康相關）在內窺鏡不復發患者體內更明顯。同樣，內窺鏡復發患者在M0和M6時間點之間觀察到的α多樣性降低，但在不復發患者中未發現。以同樣的方式，在M6時期，與內窺鏡不復發患者相比，內窺鏡復發患者的α多樣性更低，表明其腸道菌群生態系統發生了更強烈的變化。此外，根據內窺鏡復發的情況，M6時期迴腸粘膜相關菌群的組成也有區別。有趣的是，M6時期具有臨床疾病活動度患者（HBI≥4）和沒有臨床疾病活動度患者（HBI＜4）體內微生物群的α和β多樣性沒有差異，這表明腸道菌群與臨床特徵並沒有很好的相關性，但與內窺鏡情況密切相關，這說明了其作為一個粘膜癒合的生物標誌物的潛力。與健康受試者相比，內窺鏡復發患者體內觀察到的主要變化令人回想起與迴腸CD相關的改變，即來自變形菌門的幾個類群的增加，來自厚壁菌門的幾個類群（尤其是Lachnospiraceae和Ruminococcaceae等菌科）的減少。研究者比較關注Faecalibacterium prausnitzii，因為研究者在先前的研究中證實其在M0時期的丰度可以預測M6時期術後的內窺鏡復發情況。此外，其他研究組還觀察到低水平的F. prausnitzii可能與手術後內窺鏡復發有關。確實，在本文的研究群體中，F. prausnitzii的水平非常低，經過測序僅在M0和M6時期不足10%的患者中檢測到。因此，研究者使用實時定量qPCR來達到更高的敏感度。使用該方法，研究者確實在M6時期觀察到F.prausnitzii的丰度可以適度地從內窺鏡不復發患者（Rutgeerts≥i0）中區分復發患者（Rutgeerts≥i1）。研究群體中幾乎無法檢測到F. prausnitzii的水平使其無法成為預後指標。本研究中在第三研究中心招募的患者群體難治可能是F. prausnitzii極低水平的一個解釋。與Mondot及其同事先前發表的研究相似，Enterococcus菌屬的高含量和Dorea菌屬的低含量與內窺鏡復發相關。與POCER及其同事的研究不同，本研究並沒有確定Proteus菌屬與內窺鏡復發相關。這可能與環境因素的差異相關（本研究在法國進行，POCER的研究在澳大利亞進行）或因為POCER研究中所有患者均在術後3個月內接受了滅滴靈的治療。
本研究使用的兩個方法中，手術時的腸道菌群均可預測術後的內窺鏡復發。在隨機森林方法中，添加臨床因素甚至無法改善模型。在最具區別的特徵中，來自γ-變形菌綱、R.gnavus group和棒桿菌屬的細菌出現高丰度預示著復發。在很多研究中已表明，γ-變形菌綱和R.gnavus的高丰度與迴腸CD相關。棒桿菌屬與IBD、伴隨/不伴隨IBD的原發性硬化性膽管炎以及狗的突發性炎症性腸病相關。這些數據表明這些類群可能參與了疾病的發病機制。有趣的是，接受抗-TNF藥物作為術後治療的患者中，這些微生物群參數預測復發的能力喪失了，證實了這些治療手段對預防復發具有一定功效，並表明它們具有改變自然疾病進程的作用。
研究者的結果證實，微生物多樣性的減少與腸道炎症過程有關。這些微生物群的改變可能與其它生物學參數（包括宿主免疫響應在內）有關，甚至可以影響它們。最近，研究者分析了研究群體中57個患者的T細胞庫。無性系T細胞的擴增導致手術時T細胞多樣性的減少，這與術後內窺鏡復發有關。這些無性系細胞的擴增可能也與微生物的改變有關。
本研究有幾個侷限性：
① 首先，研究群體各種各樣且大多數是第三研究中心招募的代表。
② 其次，儘管這項研究具有預測性，但並未進行內窺鏡檢測的主要解讀。
③ 第三，所有結果均基於迴腸粘膜相關的微生物群，並沒有糞便微生物的數據。
關於復發預測因素的研究，儘管研究者將研究群體通過隨機森林的方法劃分為訓練組和驗證組，但仍需嚴格獨立的群體以驗證當前的發現。該群體正在準備中，且研究者計劃在接下來的幾年裡在另一個研究群體中驗證這些結果。
總之，這項研究證實了手術對迴腸粘膜相關微生物群具有重要影響，術後內窺鏡復發與其組成和α多樣性的改變有關。腸道菌群具有預測術後疾病演變和復發的潛力，但其在CD手術前頻繁使用抗生素的情況下受到限制。需要進行獨立的研究來確認這些結果。
評論
大約有50%~75%的克羅恩病患者在他們的病程中要接受至少一次的腸切除術，但術後疾病複發率非常頻繁。儘管目前手術後的第一年進行迴腸結腸鏡檢查仍然是診斷復發的金標準，但它只能在手術後數月進行，並不利於預防疾病復發的早期干預措施。為此，研究者建立了一個大型前瞻性的研究。在該研究中，研究者利用手術時和術後內窺鏡評估時採集的迴腸樣本，評估了迴腸粘膜相關的微生物群對術後內窺鏡復發的預測潛力，從而利於患者術後及早調整治療方案。
閱讀更多 營養醫學 的文章
