編譯 | 欒曉東
（隨著繼續優化此方案，將上傳更新的版本，有興趣使用患者樣品測試該方案的科研團隊可以通過發送電子郵件，請求指導 [email protected]，並且可應要求提供有限數量的Cas13酶、crRNA和側向報道基因的起始樣品）
<strong>（重要說明：此協議不得用於臨床目的，因為他們無法獲取患者樣本，因此無法使用真實的患者樣本來驗證該測定。）
一、概述
臨床醫生和科學家們目前雖然可以使用qPCR，來診斷新型冠狀病毒COVID-19，但由於試劑和設備的不足，可能一定程度上減慢疾病檢測的速度。為了幫助推進COVID-19的診斷，在此描述一種基於CRISPR的SHERLOCK(高靈敏度酶促解鎖）技術，檢測COVID-19的方案。使用合成的COVID-19病毒RNA片段，能夠在20到200 aM（每微升輸入10-100拷貝數）之間一致地檢測COVID-19靶序列。從用於qRT-PCR測試的核酸提取開始，本檢測方案分為三個步驟，並且可以在1小時內完成。
步驟（1）孵育25分鐘（使用重組酶聚合酶擴增（RPA）試劑盒等溫擴增提取的核酸樣品）；
步驟（2）孵育
30分鐘（使用Cas13檢測預先擴增的病毒RNA序列）；步驟（3）孵育2分鐘（使用的試紙/層析紙讀取檢驗結果）。
以下各節詳細介紹了所需的試劑和步驟。
二、標本和核酸提取：
應根據適當的生物安全程序收集患者樣本，參考2020 CDC COVID-19方案，有關樣本收集和後續核酸提取的詳細信息。從步驟（1）開始，此方案的輸入可以是與qRT-PCR分析中使用相同的核酸。
A材料和試劑
試劑：重組酶聚合酶擴增（RPA）試劑盒（TwistAmp®Basic；TABAS03KIT)；ProtoScript®II逆轉錄酶（M0368L）；裂解緩衝液（在ddH2O中為400mM Tris pH 7.4）；RNA酶抑制劑；T7 RNA聚合酶；核糖核苷酸溶液套裝；氯化鎂溶液；用於稀釋Cas13蛋白原液的存儲緩衝液（結合2.5 mL 1M Tris pH 7.4、6mL 5M NaCl，2.5 ml甘油和100μL1M DTT和38.9 ml ddH2O）；LwaCas13a蛋白；HybriDetect試紙條（MGHD 1)。
設備： 37℃水浴鍋、42℃水浴鍋、微量離心機，適配1.5mL EP管。
引物：靶向S基因的RPA擴增引物對
S-RPA-Forward_v1：
5’-GAAATATACTACGACGACTGATCACATACTACTTCTGTT TACATAGA-3’；
S-RPA-Reverse_v1:
5'-TCCTAGGTTGAAGATAACCCACATAATAAG-3'；
針對Orf1ab引物對
Orf1ab-RPA-Forward_v1：
5’-GAATAATATACGACTACGGAGGAGTGTGAGATAGACATAT
ActAAAC-3’；
Orf1ab-RPA-Reverse_v1:
5'-TAGTAAGACTAGAATTGTCTACATAAGCAGC-3'；
用於檢測S基因的LwaCas13acrRNA
S-crRNA_v1：
5’-GuuuAgAccCCAAACAGGAGGACUCAAACAGCGACCAC
AGCUGUCCAACCUGAAGAAG-3；
用於檢測Orf1ab基因的LwaCas13acrRNA
Orf1ab-crRNA_v1：
5’-GuuuaGaCuCCAAACAGGAGGGACUACAUACACUCUCU
UCUGUAAUUUUUAAACUAU-3'；
讀出橫向血的報告基因RNA：
Lateral-Flow-Reporter：
5'-/56-FAM / mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA/3Bio/-3'；
陽性對照序列（可以使用T7轉錄從合成的DNA寡核苷酸產生）：
新冠病毒S基因片段：
5'UAACAUCACUAGGUUUCAAACUUUACUUGCUUUACAUAGAAGUUAUUUGACUCCU
GGUGAUUCUUCUUCAGGUUGGACAGCUGGUGCUGCAGCUUAUUAUGUGGGUUAUC
UUCAACCUAGGACUUUCUCUUUAAUAAAUAUAAUGAAAAUGGAACCAUGACUGUACA
GAUGCUGAGAU
新冠病毒Orf1ab基因片段：
5'GAAAUUAAUACGACUCACUAUAGGGACUCUUGAAACUGCUCAAAAUUCUGUGCGU
GUUUACAGAAGGCCGCUAUAACAAUACUAGAUGGAAUUUCACAGUAUUCACUGAGA
CUCAUUGAAUUGCUAUGACUUCAUGAUGAUUCACAUCUGAUUUGGCUACUAACAUA
UAUACUAUGACUUGAUCUGAUCUGAUCCUAU
B實驗步驟：
提示：為防止樣品汙染，需使用兩個不同的工作區域來執行步驟（1）和（2）。步驟（1）應該在前置放大區域中進行，其對汙染非常敏感。請勿在步驟（1）的工作區域中打開擴增的樣品，步驟（2）、步驟（3）需要一個單獨的區域（擴增後區域）執行。所有反應應在指定溫度下孵育之前在冰上進行。
步驟（1）等溫擴增：
1、為了測試每個樣品，設置兩個RPA反應，分別檢測S基因靶標和Orf1ab靶標。此外，可以使用合成病毒片段建立S基因和Orf1ab的陽性對照。還應建立不添加測試樣品的陰性對照。使用RPA試劑盒中提供的29.5ul的Rehydration Buffer重懸每個凍乾的RPA沉澱。
2、對於S基因，可以如下設置每個反應：
3、對於Orf1ab基因，可以如下設置每個反應：
4、充分混合後，在預熱的水浴中於42°C孵育25分鐘。孵育結束後，立即將EP管放回冰上，直到準備加入步驟（2）中的反應中。
步驟（2）使用Cas13檢測病毒RNA序列
1、取一份LwaCas13a儲備蛋白的等分試樣（2 mg/mL，4 ul），使用122.5 uL的存儲緩衝液重懸。
2、對於每個S基因RPA反應，按以下步驟建立Cas13檢測反應：
3、對於每個Orf1ab基因RPA反應，如下設置Cas13檢測反應
4、設置完所有反應後，渦旋充分混合，並使用臺式離心機離心，接下來在預熱的37°C水浴鍋中於孵育30分鐘。孵育後，將反應管放回冰上，繼續進行步驟（3）。
步驟（3）–通過試紙條直觀地讀取檢測結果
1、步驟（2）之後，向每個20ul反應物中添加80ul HybriDetect分析緩衝液並充分混合，將稀釋的反應液置於室溫下的管架中。
2、將HybriDetect試紙條放入每個反應管中，然後等待反應流過試紙條。
3、陽性對照樣品應顯示兩條線，而陰性對照樣品應僅顯示底線。
4、對於每個測試樣品，檢查S和Orf1ab基因是否都出現兩行，表明新冠病毒結果呈陽性。
三、實驗結果：
使用合成新冠病毒S基因和Orf1ab基因RNA片段的梯度稀釋液，能夠檢測到每微升10-100拷貝的合成新冠病毒RNA序列的。以下是針對不同輸入濃度的示例圖像：
四、附加信息：
可以在以下參考中找到用於設置基於SHERLOCK檢測的詳細通用方案：
SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases. Kellner MJ, Koob JG, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, and Zhang F. Nature Protocols. 2019 Oct;14(10):2986-3012. doi: 10.1038/s41596-019-0210-2.
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