撰文 | Leon
目前，對新冠病毒SARS-CoV-2的臨床檢測（包括CDC推薦的方案）需要從患者樣本中提取RNA進行RT-qPCR。這些RNA提取的步驟使整個檢測過程複雜化，並且所需的檢測試劑供應十分緊張。因此，許多實驗室都在開發快速簡便的檢測方案。幾天前，美國Broad Institute的張鋒實驗室發佈了一個新的替代方案。該protocol只需要花5分鐘的時間，不需要進行提取RNA的繁瑣操作。此protocol與鼻咽拭子採樣兼容，且不影響RT-qPCR敏感度。
注意：該protocol尚未被批准用於臨床，也未在大量患者樣本上進行過驗證。
現在的主要檢測手段是基於RT-qPCR的方法。其他的比如血清學的檢測也在廣泛應用，但是基於PCR的方法對於檢測早期的感染者還是非常必要的。很多基於PCR的方法（還有基於等溫擴增的方法）已經在臨床上進行應用了（詳情請查閱https://www.fda.gov/medical-devices/emergency-situations-medical-devices/emergency-use-authorizations#covid19ivd）。這些方法在檢測之前都無一例外需要提取RNA。
由於提取試劑盒的缺乏和通量比較低，RNA的提取成為病毒檢測的瓶頸。因此，張鋒實驗室開發了一個一步到位，不需要離心，5分鐘內可以完成的方法。該方法可以直接跟CDC的RT-qPCR方案聯合使用，提高檢測通量和降低試劑供應鏈斷裂造成的影響。
試劑：
· Lucigen的QuickExtract™ DNA Extraction Solution（QE09050，以下簡稱QE）融化後，分裝儲存於-20℃，避免反覆凍融超過3次。
· 儲存於病毒運輸培養液（Viral Transport Medium）的鼻咽拭子。
步驟：
1. 用QE按照1：1稀釋來自陽性患者或健康人的鼻咽拭子樣本。比如在一個PCR管裡面，混合20 μL的拭子樣本和20 μL的QE。
2. 混合好後95℃孵育5分鐘，進行下一步之前在冰上冷卻。
3. 從qRT-PCR反應的第二步開始，加入量為10%的總體積。例如，如果反應的總體積是50 μL，使用5 μL。研究者測試了一系列的buffer，最後確定了QE。所有測試過的buffer裡面，QE呈現的結果與標準的RNA提取試劑盒最接近。它能夠高效地裂解病毒，並且保留RT-qPCR反應的活性（使用CDC推薦的TaqPath™ 1-Step RT-qPCR Master Mix）。
為了確定QE沒有影響RT-qPCR的活性，實驗人員把合成的SARS-CoV-2基因片段（TwistSynthetic SARS-CoV-2 RNA Control 1，SKU：102019）溶解在dd水或dd水和QE 1：1混合的體系裡進行了RT-qPCR。每個反應的總體積為10 μL（1 μL的RNA樣本，0.5 μL的CDC探針N1，2.5 μL的TaqPath™RT-qPCR master mix，6μL的dd水）。在這些反應裡，我們發現QE終濃度5%時沒有降低RT-qPCR的靈敏度（圖1A）。
實驗者用4個COVID-19陽性的鼻咽拭子樣本對這個方案進行了驗證，發現QE和標準的RNA提取試劑QIAmp Viral RNA Miniprep (Qiagen)的靈敏度類似（圖1B）。為了模擬低程度的病毒感染，在提取RNA之前，研究人員把病毒陽性的鼻咽拭子樣本按照1：10稀釋。用QIAmpViral RNA Miniprep提取時用了100 μL的拭子樣本，最後用100 μL的dd水洗脫。每個10 μL的RT-qPCR反應中含有1μL的洗脫樣本或1μL的QE提取樣本。
圖1.（A）對溶解於水或QE：水=1：1的SARS-CoV-2RNA進行RT-qPCR。最終反應體積為10μL裡面含有1μL的樣本。（B）稀釋過的COVID-19陽性樣本用QE在95℃孵育5分鐘或用QIAmpViral RNA Miniprep提取RNA，然後進行RT-qPCR。
張鋒實驗室提出了一種不依賴於RNA提取試劑盒的樣本提取方法，可以適用於基於RT-qPCR的COVID-19檢測。對許多buffer進行測試後發現，這種用QE進行RNA提取的方法和FDA批准的RNA提取試劑盒的效果相似。但是，這種方法只在少量的臨床樣本上進行了驗證，在真正應用於臨床之前應該得到相關部門的審查和許可。
原文鏈接：https://zlab.bio/s/Ladha-et-al.pdf
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