撰文 | 十一月
microRNA是來源於前體轉錄本的約22核苷酸的非編碼RNA調控序列【1】。每個miRNA都與一個Argonaute（AGO）蛋白形成一個沉默複合體，miRNA與靶標轉錄本配對隨後AGO蛋白促進靶標變得不穩定或者是進行轉錄抑制【2】。哺乳動物中最保守的90個miRNA家族有平均超過400個保守的靶標。這保守的90個miRNA家族通過小鼠中的敲除實驗已經發現對於動物的正常生長髮育和生理過程有著非常重要的作用【1】。miRNA結合靶點的效率對於理解miRNA的作用過程和作用機制大有裨益，但是對於miRNA-AGO複合物與靶標轉錄本之間結合親和力的檢測一直沒有很好的方法。
近日，Whitehead研究所David P. Bartel研究組在Science發表文章The biochemical basis of microRNA targeting efficacy，對RNA bind-n-seq（RBNS）測序進行優化，用於測量miRNA-AGO複合體與所有小於12nt靶標結合的相對親和力的大小，為定量測量miRNA對於基因調控網絡的結合效率提供了重要的生物化學基礎。
靶標結合的效率是miRNA-AGO複合體與靶標序列之間的親和力的大小，在這種情況下，與目標位點的更大親和力將導致該位點的佔用率增加，從而增加對目標mRNA的抑制。直到最近，僅有三個miRNA對於極少數的靶標mRNA的結合親和力是被深入研究過的【3-5】。高通量的成像和切割分析提供了眾多miRNA中僅let-7a和miR-21兩個的大量結合和切割方面的數據【6】。但是這其中給出的數據仍然不足以對不同miRNA之間的靶向性不同機理更加深入的瞭解，也無法建立miRNA介導的抑制作用相關的、更為普遍的非切割模式的靶向效能信息生化模型【6】。
為了能夠擴展目前對於miRNA結合靶標親和力的認識，作者們對RBNS技術進行了升級改造【7】，RBNS技術可以提供對RNA結合蛋白與結合位點的相對結合的定性測量。在該方法中，純化後的RNA結合蛋白與一個大的RNA分子庫進行孵育，所有的RNA分子都具有一個相同的引物結合序列。在達到結合平衡後，該蛋白被pull-down下來，任何被共同純化下來的RNA分子被反轉錄、擴增然後進行測序（圖1） 。為了將該技術擴展到對於AGO-miRNA複合體中進行使用，作者們純化了AGO2-miR-1【8】，並且設置了五個不同濃度的結合反應實驗，以及具有37nt隨機結合序列的RNA庫。進一步地，作者們在pull-down蛋白時改用了硝化纖維素膜，可以增加低親和力蛋白的滯留。優化後的方法提供了AGO2對於其結合位點的相對強度的量化，而且沒有差異交聯效率的混淆效應，使得該方法能夠用於miRNA靶向的定量測量。
圖1 RBNS用於AGO-miRNA與靶標mRNA親和力測量的模式圖
隨後作者使用優化後的RBNS對另外的哺乳動物中let-7、miR-7、miR-124、miR-155以及線蟲中lsy-6的這五個miRNA的結合親和力進行了測量。選擇let-7、miR-7、miR-124、miR-155是因為這些miRNA序列保守而且已經對於其調控活性、體內結合位點以及體外的結合親和力數據有一定的瞭解。而選擇lsy-6是因為該miRNA已知對於其靶點的結合能力非常微弱。作者們通過RBNS後的結果分析發現這些miRNA對於經典靶點具有很好的結合，說明該高通量技術具有很好的適應性。而對於一些非經典的結合，部分在之前的文章中有零星報道，而另外一些非經典的結合可能是對於哺乳動物細胞中有著廣泛的抑制，數據結果與背景無太大差異。
為了進一步確認該技術的作用，作者們在細胞中對miRNA轉染後對於靶點抑制效率與其測量得到的相對平衡解離常數之間的對應進行檢測。作者們發現在細胞中的結果與相對KD常數之間有著很好的對應關係。有了這樣在細胞內相對一致的抑制關係，作者們通過測量一個miRNA與任何12nt序列的相對結合親和力，來模擬6個miRNA對每個細胞mRNA的定量影響，建立了一個生物化學框架用以預測一個miRNA對於每個mRNA的抑制程度。
總的來說，作者們通過將RBNS技術進行改造，建立了一種對miRNA-AGO複合體與靶點高通量相對結合親和力檢測的方式，建立了對於miRNA-靶點相互作用的網絡，對於未來更好地瞭解和預測miRNA靶向功能提供了重要的生物化學基礎。
原文鏈接：
https://science.sciencemag.org/content/early/2019/12/04/science.aav1741
製版人：珂
參考文獻
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