撰文 | 十一月
microRNA是来源于前体转录本的约22核苷酸的非编码RNA调控序列【1】。每个miRNA都与一个Argonaute（AGO）蛋白形成一个沉默复合体，miRNA与靶标转录本配对随后AGO蛋白促进靶标变得不稳定或者是进行转录抑制【2】。哺乳动物中最保守的90个miRNA家族有平均超过400个保守的靶标。这保守的90个miRNA家族通过小鼠中的敲除实验已经发现对于动物的正常生长发育和生理过程有着非常重要的作用【1】。miRNA结合靶点的效率对于理解miRNA的作用过程和作用机制大有裨益，但是对于miRNA-AGO复合物与靶标转录本之间结合亲和力的检测一直没有很好的方法。
近日，Whitehead研究所David P. Bartel研究组在Science发表文章The biochemical basis of microRNA targeting efficacy，对RNA bind-n-seq（RBNS）测序进行优化，用于测量miRNA-AGO复合体与所有小于12nt靶标结合的相对亲和力的大小，为定量测量miRNA对于基因调控网络的结合效率提供了重要的生物化学基础。
靶标结合的效率是miRNA-AGO复合体与靶标序列之间的亲和力的大小，在这种情况下，与目标位点的更大亲和力将导致该位点的占用率增加，从而增加对目标mRNA的抑制。直到最近，仅有三个miRNA对于极少数的靶标mRNA的结合亲和力是被深入研究过的【3-5】。高通量的成像和切割分析提供了众多miRNA中仅let-7a和miR-21两个的大量结合和切割方面的数据【6】。但是这其中给出的数据仍然不足以对不同miRNA之间的靶向性不同机理更加深入的了解，也无法建立miRNA介导的抑制作用相关的、更为普遍的非切割模式的靶向效能信息生化模型【6】。
为了能够扩展目前对于miRNA结合靶标亲和力的认识，作者们对RBNS技术进行了升级改造【7】，RBNS技术可以提供对RNA结合蛋白与结合位点的相对结合的定性测量。在该方法中，纯化后的RNA结合蛋白与一个大的RNA分子库进行孵育，所有的RNA分子都具有一个相同的引物结合序列。在达到结合平衡后，该蛋白被pull-down下来，任何被共同纯化下来的RNA分子被反转录、扩增然后进行测序（图1） 。为了将该技术扩展到对于AGO-miRNA复合体中进行使用，作者们纯化了AGO2-miR-1【8】，并且设置了五个不同浓度的结合反应实验，以及具有37nt随机结合序列的RNA库。进一步地，作者们在pull-down蛋白时改用了硝化纤维素膜，可以增加低亲和力蛋白的滞留。优化后的方法提供了AGO2对于其结合位点的相对强度的量化，而且没有差异交联效率的混淆效应，使得该方法能够用于miRNA靶向的定量测量。
图1 RBNS用于AGO-miRNA与靶标mRNA亲和力测量的模式图
随后作者使用优化后的RBNS对另外的哺乳动物中let-7、miR-7、miR-124、miR-155以及线虫中lsy-6的这五个miRNA的结合亲和力进行了测量。选择let-7、miR-7、miR-124、miR-155是因为这些miRNA序列保守而且已经对于其调控活性、体内结合位点以及体外的结合亲和力数据有一定的了解。而选择lsy-6是因为该miRNA已知对于其靶点的结合能力非常微弱。作者们通过RBNS后的结果分析发现这些miRNA对于经典靶点具有很好的结合，说明该高通量技术具有很好的适应性。而对于一些非经典的结合，部分在之前的文章中有零星报道，而另外一些非经典的结合可能是对于哺乳动物细胞中有着广泛的抑制，数据结果与背景无太大差异。
为了进一步确认该技术的作用，作者们在细胞中对miRNA转染后对于靶点抑制效率与其测量得到的相对平衡解离常数之间的对应进行检测。作者们发现在细胞中的结果与相对KD常数之间有着很好的对应关系。有了这样在细胞内相对一致的抑制关系，作者们通过测量一个miRNA与任何12nt序列的相对结合亲和力，来模拟6个miRNA对每个细胞mRNA的定量影响，建立了一个生物化学框架用以预测一个miRNA对于每个mRNA的抑制程度。
总的来说，作者们通过将RBNS技术进行改造，建立了一种对miRNA-AGO复合体与靶点高通量相对结合亲和力检测的方式，建立了对于miRNA-靶点相互作用的网络，对于未来更好地了解和预测miRNA靶向功能提供了重要的生物化学基础。
原文链接：
https://science.sciencemag.org/content/early/2019/12/04/science.aav1741
制版人：珂
参考文献
1. Bartel, D. P. Metazoan MicroRNAs. Cell 173, 20-51, doi:10.1016/j.cell.2018.03.006 (2018).
2. Jonas, S. & Izaurralde, E. Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing. Nat Rev Genet 16, 421-433, doi:10.1038/nrg3965 (2015).
3. Wee, L. M., Flores-Jasso, C. F., Salomon, W. E. & Zamore, P. D. Argonaute divides its RNA guide into domains with distinct functions and RNA-binding properties. Cell 151, 1055-1067, doi:10.1016/j.cell.2012.10.036 (2012).
4. Schirle, N. T., Sheu-Gruttadauria, J. & MacRae, I. J. Structural basis for microRNA targeting. Science 346, 608-613, doi:10.1126/science.1258040 (2014).
5. Salomon, W. E., Jolly, S. M., Moore, M. J., Zamore, P. D. & Serebrov, V. Single-Molecule Imaging Reveals that Argonaute Reshapes the Binding Properties of Its Nucleic Acid Guides. Cell 162, 84-95, doi:10.1016/j.cell.2015.06.029 (2015).
6. Becker, W. R. et al. High-Throughput Analysis Reveals Rules for Target RNA Binding and Cleavage by AGO2. Mol Cell 75, 741-755 e711, doi:10.1016/j.molcel.2019.06.012 (2019).
7. Lambert, N. et al. RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins. Mol Cell 54, 887-900, doi:10.1016/j.molcel.2014.04.016 (2014).
8. Flores-Jasso, C. F., Salomon, W. E. & Zamore, P. D. Rapid and specific purification of Argonaute-small RNA complexes from crude cell lysates. RNA 19, 271-279, doi:10.1261/rna.036921.112 (2013).
閱讀更多 BioArt 的文章
