趙景民：HBV cccDNA檢測技術與臨床應用

▋ 張宇, 趙景民

1 HBV cccDNA與鬆弛環狀DNA（rcDNA）在病毒複製週期中的作用及結構差異

HBV與肝細胞表面的鈉-牛磺膽酸共轉運多肽等受體結合入胞後，在細胞質中脫去病毒包膜和核衣殼，其rcDNA的基因組進入細胞核。HBV基因組為環狀部分雙鏈DNA，約為3.2 kb。負鏈長度固定，有5′端和3′端，負鏈5′端共價結合一短肽作為合 成負鏈的引物，負鏈3′端有5～8 bp的冗餘，即3′端結構；HBV正鏈為短鏈，長度不確定，一般為基因組長度的15%～50%，其5′端共價結合

(1)去除連接在負鏈5′端的病毒聚合酶及其引物，形成pf-rcDNA (proteinfree rcDNA)；

(2)去除正鏈5′端RNA引物；

(3)以負鏈為模板，補齊病毒DNA正鏈；

(4)將正鏈和負鏈的首尾連接；

(5)高度螺旋化並與組蛋白等結合形成cccDNA微小病毒染色體。

以cccDNA為模板轉錄前基因組RNA及不同長度的mRNA，翻譯成病毒多種組成蛋白。

在檢測cccDNA過程中，如何從肝組織中特異性提取cccDNA是非常重要的一步，鑑於rcDNA與cccDNA具有序列同源性，cccDNA的整段鏈信息同樣體現在rcDNA鏈上，且其丰度比cccDNA要高的多，跨缺口PCR難以完全區分cccDNA和rcDNA，如何避免rcDNA汙染是準確檢測的前提條件，是cccDNA檢測中最關鍵的步驟。基於cccDNA和rcDNA結構的差異，可通過跨正負鏈缺口設計引物探針特異性擴增cccDNA，或在cccDNA提取過程中通過核酸酶處理樣本中的非cccDNA，以減少非特異性汙染。例如檢測樣本經質粒安全ATP依賴DNA酶（PSAD）、核酸外切酶Ⅰ&Ⅲ、T5核酸外切酶等預處理以消化包括rcDNA等非共價閉合環狀形式的所有核酸形式，起到相對純化cccDNA模板的作用。但這依然不能完全排除rcDNA的汙染，因為其還有一條完整鏈可以避免DNA酶的處理，需要在檢測過程中考慮到這一重要技術問題。

2 HBV cccDNA的檢測方法及其臨床應用

2.1 Southern Blotting

Southern Blotting是檢測HBV cccDNA的經典方法，但是其檢測步驟繁瑣且耗時，包括探針製備、電泳、轉膜雜交以及顯影檢測等，難以在臨床檢測上廣泛推廣。尤其是慢性肝炎患者肝內cccDNA水平很低，0.1~1拷貝/細胞，而Southern Blotting檢測下限約為10 拷貝/細胞，限制了Southern Blotting作為有效檢測手段在臨床上應用。但是儘管多年來不斷出現很多新方法被用於定性或定量檢測cccDNA，Southern Blotting仍然是一種廣泛被大家認可的研究方法之一。

2.2 定量PCR

臨床需更靈敏的HBV cccDNA檢測技術的需求催生了PCR檢測技術在此方面的應用。傳統定量PCR被用於檢測cccDNA可以追溯至1993年，通過設計一對跨缺口的cccDNA特異性引物來達到檢測目的。由於rcDNA的正鏈和負鏈上均存在缺口，故可設計跨越兩個缺口的引物(圖1)，使rcDNA不會被擴增。在定量PCR的基礎上，研究人員發展出一系列的改進措施來增加反應的特異性。Addison等發展出競爭定量PCR，通過雙模板設計（已知數量且與cccDNA同源序列的競爭模板與未知數量待檢測的目標模板），競爭性結合cccDNA特異性引物（圖2）。

在PCR 進行時, 兩者在同一反應管內競爭同一引物, 但競爭子和目標模板的PCR產物長度是不同的，兩者在凝膠電泳時很容易區分開，因此可利用Southern電泳方法檢測，因為PCR產物的大小不同，通過計算已知競爭模板與未知目標模板之間檢測量的差異獲得檢測結果。該檢測方法與傳統Southern Blotting比較，由於模板量增加而增加檢測靈敏度。相對於普通定量PCR方法，由於cccDNA特異性引物與rcDNA的低結合度而使檢測特異性有所提高，但在高濃度rcDNA情況下尚不能完全排除其對cccDNA檢測帶來的汙染。除此之外，實驗人員還設計了巢式PCR，通過兩對引物兩次PCR的設計來增加反應的特異性。研究人員通過巢式PCR檢測cccDNA而鑑定隱匿性HBV感染，探討隱匿性HBV感染對“隱源性”肝癌的發生進行評估。其檢測結果表明73%入組的不明原因HCC患者與HBV隱匿性感染有關，且非腫瘤組織的檢出率高於腫瘤組織。

對於cccDNA特異性擴增定量檢測，cccDNA的選擇性分離和富集是必需的。2015年，磁性納米粒子首次被引入捕獲特定的cccDNA。利用這種方法將捕獲的cccDNA通過變性釋放並進一步加工用於傳統的定量PCR。通過這樣的設計一定程度上提高了檢測的特異度和靈敏度。

CHB患者臨床上抗病毒治療後，痕量的cccDNA在感染細胞的細胞核中持續存在，而微滴式數字PCR檢測系統的發展

2.3 滾環PCR

除此之外，滾環擴增是cccDNA檢測中一種重要方法，尤其是在石蠟包埋組織中。由於組織固定劑隨著固定條件及固定時間導致DNA的降解及甲基化等原因，石蠟包埋肝組織中的cccDNA含量比新鮮冷凍保存組織要低100多倍，一般定量PCR不能滿足檢測條件，通過滾環擴增模板並結合實時定量PCR擴大檢測技術的靈敏度，減少整合HBV DNA的影響，而使得臨床常規石蠟包埋肝組織樣本中cccDNA檢測得以實現。

國際上cccDNA檢測方法主要基於新鮮肝穿刺組織且難以定量，限制了其臨床推廣應用。團隊研發了一種基於常規石蠟切片的滾環聯合跨缺口引物擴增的HBV cccDNA熒光定量新技術，解決了這一難題，首次明確了cccDNA評價治療終點的標準閾值，獲臨床應用准入，取得顯著的臨床和社會效益。該技術是在以往實時熒光定量PCR之前增加了一步跨缺口滾環擴增，由於非cccDNA形式的HBV在基因結構上是不完全的雙鏈環狀或線狀，滾環擴增反應不能連續進行，只有cccDNA才能獲得特異性地大量擴增。該技術最低可檢測到10個拷貝的cccDNA分子，並可獲得所有擴增cccDNA的全基因序列。

以上cccDNA檢測技術都只是進行定量檢測，而無法進行定位及分佈檢測。該研究團隊在前期研究基礎上進一步開展石蠟包埋肝組織切片原位PCR檢測cccDNA，其可以原位擴增顯示cccDNA含量，也避免了Southern Blotting一系列複雜的操作步驟，同時相對於原位雜交來說，可以將低拷貝的cccDNA通過擴增檢測出來。通過預先的PSAD酶處理消化去除了非cccDNA的影響，配合特異性標記跨缺口引物的使用，使得整體

2.4 原位雜交

原位雜交應用於檢測cccDNA可起始於1998年，利用DIG標記的單鏈探針檢測感染HBV的細胞內cccDNA水平，但是並沒有檢測肝組織內cccDNA水平。這一技術一直較少應用至臨床檢測，而Zhang等對這一技術的改進，大大提高了其靈敏度和特異度，可原位檢測cccDNA並且可以在單細胞的水平檢測HBV RNA、DNA和cccDNA，並通過其嚴格的核內信號和一系列Southern Blotting分析得到證實cccDNA探針組的特異度。使用該原位測定結合免疫組化或免疫熒光發現了令人驚訝的病毒抗原和核酸的鑲嵌分佈。最引人注目的是，在HBV表面抗原陽性與HBV DNA及cccDNA陽性細胞之間發現了相互排斥的模式。在1年的阿德福韋治療期間對患者進行縱向觀察證實了病毒DNA核儲存的持續存在，儘管這些個體中細胞質DNA被有效消耗。該方法對臨床檢測單細胞水平上病毒核酸（包括cccDNA）的應用，提供了監測慢性HBV感染中的肝內病毒學載量及分佈的手段。更重要的是，該方法的應用揭示了體內HBV生命週期的複雜性。

2.5 檢測方法的選擇

目前，cccDNA檢測尚未有標準、高效的檢測方法，也是臨床亟待解決的問題之一。在已有的檢測方法中，Southern Blotting作為一種經典方法，其結果可靠且可重複性較好，但操作繁瑣耗時，靈敏度不高，更多作為實驗室技術使用。定量PCR近年來發展迅速，其操作簡單，可高通量檢測，其中競爭定量PCR的靈敏度比Southern Blotting方法要高，可從電泳條帶上區分rcDNA和cccDNA，但當rcDNA含量較高時，這種條帶區分方法受到限制。微滴式數字PCR相對於傳統PCR來說，其靈敏度得到很大的提升，因此針對病毒低拷貝的患者肝內cccDNA檢測具有一定的優勢，但當模板載量高於106拷貝時，其理論值與實際值之間存在偏差。筆者團隊設計了滾環擴增聯合跨缺口引物PCR設計並將其應用於石蠟組織切片中，極大地擴大了臨床樣本使用範圍，可以在單細胞水平定位或定量檢測cccDNA，並與組織形態變化相聯繫，但固定液引起的蛋白交聯或DNA甲基化可能會影響PCR擴增效果，需綜合考慮檢測結果。有研究者通過對原位雜交技術的改良，結合支鏈DNA(branched DNA, bDNA)擴增放大信號和熒光標記，能夠實現可視可定位特異性檢測cccDNA，但是其檢測探針設計複雜，技術要求較高。

3 HBV cccDNA與血清學標誌物的關係

血清中HBV DNA水平是指導抗病毒治療非常重要的臨床指標，與肝內cccDNA水平顯著相關，但是核苷酸類似物抗病毒治療雖然能使血清中HBV DNA迅速轉陰，但是對肝內cccDNA作用有限。若在此時停藥往往會出現病毒學反彈甚至病情加重。而即使接受長達10年以上的抗病毒治療，且血清中HBV DNA水平持續低於檢測下限，但肝內仍然可以檢測到cccDNA，因此如何聯合其他血清中的病毒學指標來更準確地反映肝內cccDNA存在與複製情況是目前臨床檢測的挑戰之一。

有研究顯示，血清中HBV RNA和乙型肝炎核心相關抗原（HBcrAg）水平在HBV DNA低於檢測下限後可以很好地應用於抗病毒治療中病毒學應答的檢測，並反映肝內cccDNA複製與轉錄情況，但這一結果是否可應用於指導確定臨床抗病毒治療停藥終點尚待進一步研究。

HBsAg消失是臨床治癒目標，研究表明長期抗病毒治療伴隨著HBsAg和cccDNA明顯降低，但是HBeAg陰轉後，血清HBsAg與cccDNA相關性顯著下降，而且低水平HBsAg陽性並不意味著肝內一定有cccDNA存在，實驗證明整合HBV DNA也是HBsAg分泌來源之一。

此外，檢測肝組織中cccDNA對於瞭解HBV感染者病情和傳染性有參考價值，尤其對於隱匿性HBV感染（OBI），cccDNA檢測技術的發展增強了對這一臨床問題的認識。Caviglia等對OBI患者肝內cccDNA進行檢測，並與血清中抗-HBc IgG水平進行相關性分析，結果表明抗-HBc IgG抗體可以反映肝內cccDNA水平，提示OBI患者病毒再激活的可能性，尤其是接受免疫抑制劑治療或免疫功能低下的特殊人群需要臨床上

4 HBV cccDNA檢測的臨床意義

HBV cccDNA水平被認為是一個有價值的反映肝內病毒複製水平的標誌物，在臨床抗HBV治療期間檢測cccDNA的變化，有助於判斷臨床療效以及治療策略的調整。目前CHB患者抗病毒治療的理想治療終點是臨床治癒，即血清HBsAg消失，伴有或不伴有抗-HBs陽轉，但此時肝內依然可能存在cccDNA複製。而達到徹底治癒，除卻血清中HBsAg以及HBV DNA檢測不到，肝內cccDNA和整合HBV DNA都被清除，因此可靠的cccDNA檢測技術對於判定CHB的臨床治癒情況至關重要。

目前普遍為大家所接受的觀點認為，抗病毒治療過程中，即使發生了HBsAg血清學轉換，肝內依然存在病毒複製，只有徹底清除了肝細胞內的cccDNA才能實現徹底治癒，因為cccDNA是HBV複製的原始模板。臨床中有很多經過長期抗病毒治療完全應答的患者，停止抗病毒治療後，又常常發生HBV再激活和病情復發，而HBV cccDNA在停藥後復發中起著重要作用。HBV cccDNA的存在貫穿於乙型肝炎自然史的始終，所以cccDNA 是徹底清除HBV的關鍵。肝內cccDNA可列為抗HBV新藥評估指標，監測其水平也可以輔助評價抗病毒療效和預後，更好地反映病毒複製的水平、疾病的嚴重性，顯示出其在臨床診斷和治療中的指導性作用；而通過肝活組織檢查測定cccDNA的水平，將為抗病毒治療終點的選擇提供客觀依據。

基於cccDNA在病毒持續感染與肝炎慢性化中的重要作用，阻斷cccDNA的形成或降解cccDNA已成為抗HBV治療藥物研發的有潛力的方向。譬如，通過免疫反應介導、CRISPR/Cas及RNAi基因編輯技術或表觀遺傳修飾等途徑清除已有cccDNA；通過阻斷鈉-牛磺膽酸共轉運多肽受體譬如Myrcludex B阻斷HBV播散；通過阻斷肝細胞rcDNA向cccDNA轉變等方法，以期達到徹底清除cccDNA的目的，從而實現CHB徹底治癒的最終目標。

4.2 HBV cccDNA與HBV肝外感染

HBV雖然是一種嗜肝病毒，但在許多肝外的器官（外周血單核細胞、骨髓、胰腺、腎臟、睪丸、卵巢等）均能檢測到HBV DNA或病毒抗原的報道，提示HBV有可能感染肝外器官或發生肝外定植，甚至有可能導致肝外疾病，如HBV相關性腎炎。cccDNA作為HBV複製的模板，是確定肝外器官是否感染HBV和病毒是否存在複製的最有力證據，然而，目前尚未有檢測到肝外組織存在cccDNA的確切證據。

5 總結

cccDNA是HBV持續感染、難以徹底治癒的最大臨床挑戰，通過cccDNA的檢測能夠了解病毒感染和複製狀況，評估疾病進展，抗病毒治療停藥終點的確定，評價病毒清除的最具代表性的指標，也是器官移植後、抗腫瘤治療等免疫功能低下或缺陷HBV再感染或再激活的客觀指標。目前cccDNA檢測方法主要包括滾環擴增聯合跨缺口引物設計的滾環PCR，基於bDNA信號擴增可定位顯示的原位雜交和以“油包水”微滴化提高靈敏度的微滴式數字PCR等一系列方法，其中可應用於石蠟切片的滾環PCR的研發，拓展了cccDNA檢測技術的組織樣本應用範圍，臨床適用性較好，特異度及

引證本文：張宇, 趙景民. HBV cccDNA檢測技術與臨床應用[J]. 臨床肝膽病雜誌, 2019, 35(10): 2140-2144.

《臨床肝膽病雜誌》2019年第10期

〔HBV感染“新型”生物標誌物的臨床應用〕重點號

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