赵景民：HBV cccDNA检测技术与临床应用

▋ 张宇, 赵景民

1 HBV cccDNA与松弛环状DNA（rcDNA）在病毒复制周期中的作用及结构差异

HBV与肝细胞表面的钠-牛磺胆酸共转运多肽等受体结合入胞后，在细胞质中脱去病毒包膜和核衣壳，其rcDNA的基因组进入细胞核。HBV基因组为环状部分双链DNA，约为3.2 kb。负链长度固定，有5′端和3′端，负链5′端共价结合一短肽作为合 成负链的引物，负链3′端有5～8 bp的冗余，即3′端结构；HBV正链为短链，长度不确定，一般为基因组长度的15%～50%，其5′端共价结合

(1)去除连接在负链5′端的病毒聚合酶及其引物，形成pf-rcDNA (proteinfree rcDNA)；

(2)去除正链5′端RNA引物；

(3)以负链为模板，补齐病毒DNA正链；

(4)将正链和负链的首尾连接；

(5)高度螺旋化并与组蛋白等结合形成cccDNA微小病毒染色体。

以cccDNA为模板转录前基因组RNA及不同长度的mRNA，翻译成病毒多种组成蛋白。

在检测cccDNA过程中，如何从肝组织中特异性提取cccDNA是非常重要的一步，鉴于rcDNA与cccDNA具有序列同源性，cccDNA的整段链信息同样体现在rcDNA链上，且其丰度比cccDNA要高的多，跨缺口PCR难以完全区分cccDNA和rcDNA，如何避免rcDNA污染是准确检测的前提条件，是cccDNA检测中最关键的步骤。基于cccDNA和rcDNA结构的差异，可通过跨正负链缺口设计引物探针特异性扩增cccDNA，或在cccDNA提取过程中通过核酸酶处理样本中的非cccDNA，以减少非特异性污染。例如检测样本经质粒安全ATP依赖DNA酶（PSAD）、核酸外切酶Ⅰ&Ⅲ、T5核酸外切酶等预处理以消化包括rcDNA等非共价闭合环状形式的所有核酸形式，起到相对纯化cccDNA模板的作用。但这依然不能完全排除rcDNA的污染，因为其还有一条完整链可以避免DNA酶的处理，需要在检测过程中考虑到这一重要技术问题。

2 HBV cccDNA的检测方法及其临床应用

2.1 Southern Blotting

Southern Blotting是检测HBV cccDNA的经典方法，但是其检测步骤繁琐且耗时，包括探针制备、电泳、转膜杂交以及显影检测等，难以在临床检测上广泛推广。尤其是慢性肝炎患者肝内cccDNA水平很低，0.1~1拷贝/细胞，而Southern Blotting检测下限约为10 拷贝/细胞，限制了Southern Blotting作为有效检测手段在临床上应用。但是尽管多年来不断出现很多新方法被用于定性或定量检测cccDNA，Southern Blotting仍然是一种广泛被大家认可的研究方法之一。

2.2 定量PCR

临床需更灵敏的HBV cccDNA检测技术的需求催生了PCR检测技术在此方面的应用。传统定量PCR被用于检测cccDNA可以追溯至1993年，通过设计一对跨缺口的cccDNA特异性引物来达到检测目的。由于rcDNA的正链和负链上均存在缺口，故可设计跨越两个缺口的引物(图1)，使rcDNA不会被扩增。在定量PCR的基础上，研究人员发展出一系列的改进措施来增加反应的特异性。Addison等发展出竞争定量PCR，通过双模板设计（已知数量且与cccDNA同源序列的竞争模板与未知数量待检测的目标模板），竞争性结合cccDNA特异性引物（图2）。

在PCR 进行时, 两者在同一反应管内竞争同一引物, 但竞争子和目标模板的PCR产物长度是不同的，两者在凝胶电泳时很容易区分开，因此可利用Southern电泳方法检测，因为PCR产物的大小不同，通过计算已知竞争模板与未知目标模板之间检测量的差异获得检测结果。该检测方法与传统Southern Blotting比较，由于模板量增加而增加检测灵敏度。相对于普通定量PCR方法，由于cccDNA特异性引物与rcDNA的低结合度而使检测特异性有所提高，但在高浓度rcDNA情况下尚不能完全排除其对cccDNA检测带来的污染。除此之外，实验人员还设计了巢式PCR，通过两对引物两次PCR的设计来增加反应的特异性。研究人员通过巢式PCR检测cccDNA而鉴定隐匿性HBV感染，探讨隐匿性HBV感染对“隐源性”肝癌的发生进行评估。其检测结果表明73%入组的不明原因HCC患者与HBV隐匿性感染有关，且非肿瘤组织的检出率高于肿瘤组织。

对于cccDNA特异性扩增定量检测，cccDNA的选择性分离和富集是必需的。2015年，磁性纳米粒子首次被引入捕获特定的cccDNA。利用这种方法将捕获的cccDNA通过变性释放并进一步加工用于传统的定量PCR。通过这样的设计一定程度上提高了检测的特异度和灵敏度。

CHB患者临床上抗病毒治疗后，痕量的cccDNA在感染细胞的细胞核中持续存在，而微滴式数字PCR检测系统的发展

2.3 滚环PCR

除此之外，滚环扩增是cccDNA检测中一种重要方法，尤其是在石蜡包埋组织中。由于组织固定剂随着固定条件及固定时间导致DNA的降解及甲基化等原因，石蜡包埋肝组织中的cccDNA含量比新鲜冷冻保存组织要低100多倍，一般定量PCR不能满足检测条件，通过滚环扩增模板并结合实时定量PCR扩大检测技术的灵敏度，减少整合HBV DNA的影响，而使得临床常规石蜡包埋肝组织样本中cccDNA检测得以实现。

国际上cccDNA检测方法主要基于新鲜肝穿刺组织且难以定量，限制了其临床推广应用。团队研发了一种基于常规石蜡切片的滚环联合跨缺口引物扩增的HBV cccDNA荧光定量新技术，解决了这一难题，首次明确了cccDNA评价治疗终点的标准阈值，获临床应用准入，取得显著的临床和社会效益。该技术是在以往实时荧光定量PCR之前增加了一步跨缺口滚环扩增，由于非cccDNA形式的HBV在基因结构上是不完全的双链环状或线状，滚环扩增反应不能连续进行，只有cccDNA才能获得特异性地大量扩增。该技术最低可检测到10个拷贝的cccDNA分子，并可获得所有扩增cccDNA的全基因序列。

以上cccDNA检测技术都只是进行定量检测，而无法进行定位及分布检测。该研究团队在前期研究基础上进一步开展石蜡包埋肝组织切片原位PCR检测cccDNA，其可以原位扩增显示cccDNA含量，也避免了Southern Blotting一系列复杂的操作步骤，同时相对于原位杂交来说，可以将低拷贝的cccDNA通过扩增检测出来。通过预先的PSAD酶处理消化去除了非cccDNA的影响，配合特异性标记跨缺口引物的使用，使得整体

2.4 原位杂交

原位杂交应用于检测cccDNA可起始于1998年，利用DIG标记的单链探针检测感染HBV的细胞内cccDNA水平，但是并没有检测肝组织内cccDNA水平。这一技术一直较少应用至临床检测，而Zhang等对这一技术的改进，大大提高了其灵敏度和特异度，可原位检测cccDNA并且可以在单细胞的水平检测HBV RNA、DNA和cccDNA，并通过其严格的核内信号和一系列Southern Blotting分析得到证实cccDNA探针组的特异度。使用该原位测定结合免疫组化或免疫荧光发现了令人惊讶的病毒抗原和核酸的镶嵌分布。最引人注目的是，在HBV表面抗原阳性与HBV DNA及cccDNA阳性细胞之间发现了相互排斥的模式。在1年的阿德福韦治疗期间对患者进行纵向观察证实了病毒DNA核储存的持续存在，尽管这些个体中细胞质DNA被有效消耗。该方法对临床检测单细胞水平上病毒核酸（包括cccDNA）的应用，提供了监测慢性HBV感染中的肝内病毒学载量及分布的手段。更重要的是，该方法的应用揭示了体内HBV生命周期的复杂性。

2.5 检测方法的选择

目前，cccDNA检测尚未有标准、高效的检测方法，也是临床亟待解决的问题之一。在已有的检测方法中，Southern Blotting作为一种经典方法，其结果可靠且可重复性较好，但操作繁琐耗时，灵敏度不高，更多作为实验室技术使用。定量PCR近年来发展迅速，其操作简单，可高通量检测，其中竞争定量PCR的灵敏度比Southern Blotting方法要高，可从电泳条带上区分rcDNA和cccDNA，但当rcDNA含量较高时，这种条带区分方法受到限制。微滴式数字PCR相对于传统PCR来说，其灵敏度得到很大的提升，因此针对病毒低拷贝的患者肝内cccDNA检测具有一定的优势，但当模板载量高于106拷贝时，其理论值与实际值之间存在偏差。笔者团队设计了滚环扩增联合跨缺口引物PCR设计并将其应用于石蜡组织切片中，极大地扩大了临床样本使用范围，可以在单细胞水平定位或定量检测cccDNA，并与组织形态变化相联系，但固定液引起的蛋白交联或DNA甲基化可能会影响PCR扩增效果，需综合考虑检测结果。有研究者通过对原位杂交技术的改良，结合支链DNA(branched DNA, bDNA)扩增放大信号和荧光标记，能够实现可视可定位特异性检测cccDNA，但是其检测探针设计复杂，技术要求较高。

3 HBV cccDNA与血清学标志物的关系

血清中HBV DNA水平是指导抗病毒治疗非常重要的临床指标，与肝内cccDNA水平显著相关，但是核苷酸类似物抗病毒治疗虽然能使血清中HBV DNA迅速转阴，但是对肝内cccDNA作用有限。若在此时停药往往会出现病毒学反弹甚至病情加重。而即使接受长达10年以上的抗病毒治疗，且血清中HBV DNA水平持续低于检测下限，但肝内仍然可以检测到cccDNA，因此如何联合其他血清中的病毒学指标来更准确地反映肝内cccDNA存在与复制情况是目前临床检测的挑战之一。

有研究显示，血清中HBV RNA和乙型肝炎核心相关抗原（HBcrAg）水平在HBV DNA低于检测下限后可以很好地应用于抗病毒治疗中病毒学应答的检测，并反映肝内cccDNA复制与转录情况，但这一结果是否可应用于指导确定临床抗病毒治疗停药终点尚待进一步研究。

HBsAg消失是临床治愈目标，研究表明长期抗病毒治疗伴随着HBsAg和cccDNA明显降低，但是HBeAg阴转后，血清HBsAg与cccDNA相关性显著下降，而且低水平HBsAg阳性并不意味着肝内一定有cccDNA存在，实验证明整合HBV DNA也是HBsAg分泌来源之一。

此外，检测肝组织中cccDNA对于了解HBV感染者病情和传染性有参考价值，尤其对于隐匿性HBV感染（OBI），cccDNA检测技术的发展增强了对这一临床问题的认识。Caviglia等对OBI患者肝内cccDNA进行检测，并与血清中抗-HBc IgG水平进行相关性分析，结果表明抗-HBc IgG抗体可以反映肝内cccDNA水平，提示OBI患者病毒再激活的可能性，尤其是接受免疫抑制剂治疗或免疫功能低下的特殊人群需要临床上

4 HBV cccDNA检测的临床意义

HBV cccDNA水平被认为是一个有价值的反映肝内病毒复制水平的标志物，在临床抗HBV治疗期间检测cccDNA的变化，有助于判断临床疗效以及治疗策略的调整。目前CHB患者抗病毒治疗的理想治疗终点是临床治愈，即血清HBsAg消失，伴有或不伴有抗-HBs阳转，但此时肝内依然可能存在cccDNA复制。而达到彻底治愈，除却血清中HBsAg以及HBV DNA检测不到，肝内cccDNA和整合HBV DNA都被清除，因此可靠的cccDNA检测技术对于判定CHB的临床治愈情况至关重要。

目前普遍为大家所接受的观点认为，抗病毒治疗过程中，即使发生了HBsAg血清学转换，肝内依然存在病毒复制，只有彻底清除了肝细胞内的cccDNA才能实现彻底治愈，因为cccDNA是HBV复制的原始模板。临床中有很多经过长期抗病毒治疗完全应答的患者，停止抗病毒治疗后，又常常发生HBV再激活和病情复发，而HBV cccDNA在停药后复发中起着重要作用。HBV cccDNA的存在贯穿于乙型肝炎自然史的始终，所以cccDNA 是彻底清除HBV的关键。肝内cccDNA可列为抗HBV新药评估指标，监测其水平也可以辅助评价抗病毒疗效和预后，更好地反映病毒复制的水平、疾病的严重性，显示出其在临床诊断和治疗中的指导性作用；而通过肝活组织检查测定cccDNA的水平，将为抗病毒治疗终点的选择提供客观依据。

基于cccDNA在病毒持续感染与肝炎慢性化中的重要作用，阻断cccDNA的形成或降解cccDNA已成为抗HBV治疗药物研发的有潜力的方向。譬如，通过免疫反应介导、CRISPR/Cas及RNAi基因编辑技术或表观遗传修饰等途径清除已有cccDNA；通过阻断钠-牛磺胆酸共转运多肽受体譬如Myrcludex B阻断HBV播散；通过阻断肝细胞rcDNA向cccDNA转变等方法，以期达到彻底清除cccDNA的目的，从而实现CHB彻底治愈的最终目标。

4.2 HBV cccDNA与HBV肝外感染

HBV虽然是一种嗜肝病毒，但在许多肝外的器官（外周血单核细胞、骨髓、胰腺、肾脏、睾丸、卵巢等）均能检测到HBV DNA或病毒抗原的报道，提示HBV有可能感染肝外器官或发生肝外定植，甚至有可能导致肝外疾病，如HBV相关性肾炎。cccDNA作为HBV复制的模板，是确定肝外器官是否感染HBV和病毒是否存在复制的最有力证据，然而，目前尚未有检测到肝外组织存在cccDNA的确切证据。

5 总结

cccDNA是HBV持续感染、难以彻底治愈的最大临床挑战，通过cccDNA的检测能够了解病毒感染和复制状况，评估疾病进展，抗病毒治疗停药终点的确定，评价病毒清除的最具代表性的指标，也是器官移植后、抗肿瘤治疗等免疫功能低下或缺陷HBV再感染或再激活的客观指标。目前cccDNA检测方法主要包括滚环扩增联合跨缺口引物设计的滚环PCR，基于bDNA信号扩增可定位显示的原位杂交和以“油包水”微滴化提高灵敏度的微滴式数字PCR等一系列方法，其中可应用于石蜡切片的滚环PCR的研发，拓展了cccDNA检测技术的组织样本应用范围，临床适用性较好，特异度及

引证本文：张宇, 赵景民. HBV cccDNA检测技术与临床应用[J]. 临床肝胆病杂志, 2019, 35(10): 2140-2144.

《临床肝胆病杂志》2019年第10期

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