圖1：HPV病毒（來源/互聯網）
導語
元碼基因科學團隊採用三代測序技術，快速至45分鐘就可獲得宮頸處前十種主要微生物與HPV的信息。研究成果已於北京時間12月19日在Scientific reports (IF=4.122)以題目“Simultaneous detection and comprehensive analysis of HPV and microbiome status of a cervical liquid-based cytology sample using Nanopore MinION sequencing”刊出（點擊文末“閱讀原文”可見）。
人體內環境是複雜的大自然中一個相對獨立的小環境。在這個小環境裡面有大量的微生物與我們生活在一起，其中有益生菌保護我們，也可能有病原菌傷害我們。體內微生物菌群的變化可能引起某種疾病，同時身體狀態也可能反過來作用於菌群。人類乳頭瘤病毒（human papillomavirus, HPV）是引起宮頸癌的主要病原生物，同時宮頸癌的發展可能與宮頸處微生物群落結構變化有關。
然而，市面上目前還沒有一種可以同時快速檢測HPV病毒和其他微生物的方法。因此，我們需要更好的工具對HPV等微生物進行區分鑑別分析。
針對這個問題，元碼基因科學團隊採用多重 PCR技術和Nanopore測序，只需花費 45分鐘，就可以同時得到宮頸處前十種主要微生物與 HPV的信息。具體的方法，採用多重 PCR技術擴增 HPV E6&E7 區域以及 16s 全長，並對擴增產物使用Nanopore進行測序。
經驗證，其分析結果與 Illumina 測序平臺檢測結果一致，但花費的時間大大縮短。
圖2：該項研究成果已在Scientific reports ( IF=4.122) 上刊出（來源/元碼基因，下同）
該項研究成果已於北京時間12月19日在Scientific reports ( IF=4.122) 上刊出，是目前第一篇用ONT單分子測序平臺同時快速檢測HPV感染和宮頸微生物組的文章。
一、微生物群落結構
【具體方法】元碼基因團隊分別採用Nanopore和Illumina測序平臺對微生物進行16s擴增子測序。
■ Nanopore測序平臺
測序多重PCR產物，引物分別為16s全長與HPV E6&E7 區。
■ Illumina 測序平臺
只檢測16s V4區產物。
■ 比對和註釋
Nanopore測序數據先與HPV基因組數據庫比對，得到的HPV信息作為分型鑑定的輔助依據。對於沒有比對上HPV的測序數據，繼續進行微生物物種註釋流程。
16s 分析結果顯示，Nanopore測序平臺檢測到丰度前十種微生物在不同分類水平與Illumina測序平臺一致。低丰度的rare genus種類數量，Illumina平臺檢測到的比Nanopore平臺多，其原因可能因為Illumina平臺測序深度遠大於Nanopore平臺。
圖3：不同分類水平的物種註釋（a，門水平；b，綱水平；c，目水平；d，科水平；e，屬水平）
此前已有文獻報道，同一批次測序數據如使用不同的分析方法則會產生不同的結果。這其中，比對方法與使用的數據庫有很大的影響。基於此，採用了不同的方法與數據庫分別對Nanopore測序樣品進行分析。
■ 採用不同方法與數據庫對Nanopore測序數據進行分析：1）傳統方法 QIIME + greengenes 數據庫；2）Nanopore測序常用比對軟件 LAST + greengenes 數據庫；3）Nanopore測序常用比對軟件 LAST + NCBI 16s 數據庫。
圖4a：不同分析方法的比較圖；4b 高丰度物種的親緣關係
文氏圖（圖4a）為三種方法在屬水平上物種註釋結果的比較，三種顏色的圈分別代表三種方法，中間的10表示三種方法檢測結果共有10個屬，其正好是丰度前十的微生物，說明 Nanopore 16s 全長測序結果具有很好的 robust 性。
NCBI 數據庫相比greengenes 數據庫具有一大優勢，它可以註釋到種水平，在後續臨床應用中可以為醫生提供更多的信息。系統發育樹（圖4b）為註釋到種水平的微生物以及進化關係，包含了丰度前十的十個屬。
二、快速檢測
按照不同的百分比隨機抽取Nanopore reads，以此模擬不同測序時間的註釋結果，每個百分比分別隨機抽取十次。
■ 數據抽取之後的分析結果（表1）
第一列：抽取reads的百分數；
第二列：測序的時間；
第三列：抽取的reads數；
第四列：抽取的reads中16s平均reads數；
第五列：抽取的reads 中 HPV平均reads數；
第六列：微生物丰度前十的平均reads數；
第七列：支持reads大於4時檢測到全部丰度前十的次數；
第八列：每次隨機抽取後與全部測序reads群落結構的相似程度。
從中可以看出，只需測序45分鐘就可以得到完整的微生物群落結構以及HPV信息，與MiSeq PE250大於24小時測序時間相比大大縮短。
表1：隨機抽取測序數據的分析比較
三、元碼基因依託技術平臺優勢
這項技術具有實驗步驟簡單、易於操作且花費時間短的優勢。應用到臨床檢測時，可以大大減少患者等候結果的時間。
如果檢測結果與自動化報告系統聯用，在檢測結果得出的同時，可以給醫生提供相關微生物的信息，輔助醫生針對每個患者個體制定個性化治療方案。
同時，Nanopore的flowcell可以短時間內不同批次重複使用，無需等待大量患者樣品就可以測序分析。這個優勢能夠大大降低檢測成本。
因此，元碼基因通過同時檢測HPV病毒感染和宮頸微生物組（感染或者菌群失衡）的方式，解決了疑似感染者對快速檢測的需求，把單分子測序的能力發揮了出來。
展望未來，這項技術的普及就可以讓更多的患者受益於“高質量、低價格、快時間”的個性化診療。
[1] Rebolj, M. et al. Primary cervical screening with high risk human papillomavirus testing: observational study. BMJ 364, l240 (2019).
[2] Gao, W., Weng, J., Gao, Y. & Chen, X. Comparison of the vaginal microbiota diversity of women with and without human papillomavirus infection: a cross-sectional study. Bmc Infectious Diseases 13, 271–271 (2013).
[3] Arokiyaraj, S., Seo, S. S., Kwon, M., Lee, J. K. & Kim, M. K. Association of cervical microbial community with persistence, clearance and negativity of Human Papillomavirus in Korean women: a longitudinal study. Scientific reports 8 (2018).
（封面圖來源/元碼基因）
【關於元碼基因 】
元碼基因是一家集精準醫療新技術研發、產品轉化和基因檢測服務為一體的高新技術企業。聚焦於搭建臨床腫瘤精準醫療平臺，致力於將先進的基因組學技術應用於臨床實踐，為用戶提供更可靠的精準醫療解決方案。依託完整的技術平臺，在腫瘤領域成功推出濟康、濟克、濟安系列腫瘤產品線。涵蓋腫瘤早篩早診、精準用藥和實時監控的全時段管理，最大限度地滿足不同階段腫瘤患者的需求。此外，自主研發出UCap、DeCap、TCap、PCap核心技術，以及“10K
™”系列液體活檢產品，實現腫瘤無創檢測，並率先提出“四定液體活檢”（“定量”、“定性”、“定位”、“定序”）的新一代液體活檢理念，為臨床無創腫瘤基因檢測開啟了全新模式。聲明：以上文章，僅代表個人觀點，僅供研究參考，不作為投融資及醫療等決策依據；知識版權屬於基因慧，公眾號以及機構轉載請徵得基因慧書面同意後，在正文前註明首發出處及作者姓名。
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