前言：近2月，我國武漢出現新型冠狀病毒肺炎疫情，關於肺炎的流行病學、防護和救治，相信大家都已經關注了很多內容，我在此就不再贅述。最近有多個團隊發表了新冠肺炎病理、病毒結構等相關文章，從不同水平對本病的發病機制進行了闡述，儘管到完全搞清楚疾病的本質，及特異性的治療手段的出現還需要有個過程，但這部分內容是非常重要的。內容涉及到基因，蛋白質結構，電鏡及生物信息學蛋白質構象分析等，讓我想起了以前做分子生物學試驗的那段日子，曾把分子生物學的試驗幾乎都做了一遍，想起當時和一幫師兄弟姐妹們在實驗室的日子，雖然有些遙遠了，但回想起來，仍然是很開心、溫暖，讓久違的內心激起一波漣漪，心目中一直認為把研究做到這個水平才是讓人覺得過癮和舒爽，也慚愧沒有再做更多的研究。今天，我就和綜合一下近期國內外學者們的研究結果和大家一起分享、學習一下，當雞湯補補：
2020年2月11日，國際病毒分類委員會將新型冠狀病毒正式命名為"SARS-CoV-2"， WHO也將"新冠肺炎"疾病重新命名為冠狀病毒性疾病-19（COVID-19）。"Co"代表"冠狀"，"Vi"為"病毒。"，"D"為"疾病"，而19代表最初的病例是在2019年出現。
SARS-CoV-2與SARS-CoV不同，但二者氨基酸水平有差異，屬於不同的毒株，並非一個"新病毒"。二者均有4種主要的結構蛋白：刺突表面糖蛋白（S）、小包膜蛋白（E）、基質蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）。SARS-COV-2的刺突表面糖蛋白中與人體血管緊張素轉換酶2（ACE2）蛋白結合的5個關鍵氨基酸有4個發生了變化，變化後的氨基酸，在整體性上完美地維持了SARS-CoV的刺突表面糖蛋白與ACE2蛋白相互作用的原結構構象，因此，推測SARS-CoV2可能也是通過刺突表面糖蛋白與人ACE2相互作用，感染人的呼吸道上皮細胞及其他器官細胞。
圖1-1 新型冠狀病毒結構示意圖
對新冠病毒進行測序，發現其RNA結構域如下：
圖1-2 新型冠狀病毒結構域分佈示意圖
2月17日，解放軍總醫院王福生院士團隊對一例新冠肺炎死亡患者進行了病理解剖。組織樣本取自患者的肺、肝和心臟組織。肺組織學檢查顯示雙側瀰漫性肺泡損傷伴纖維粘液性滲出(圖2A，B)。右肺組織出現明顯的肺泡上皮脫落和肺透明膜形成，提示急性呼吸窘迫綜合徵(ARDS；圖2A)。左肺組織表現為肺水腫和肺透明膜形成，提示早期ARDS(圖2B)。雙肺中均可見到間質內以淋巴細胞為主的單核細胞炎性浸潤。在肺泡腔中出現多核鉅細胞和非典型增大的肺泡細胞，其中非典型增大的肺泡細胞具有較大的細胞核，雙嗜性的細胞質內顆粒和明顯的核仁，表現出病毒性細胞病變樣改變(viralcytopathic-like changes)。未發現明顯核內或胞漿內病毒包涵體。
圖2 COVID-19患者肺、肝臟和心肌組織病理
患者的肝活檢標本顯示中度的微泡肪樣變性以及輕度的肝小葉匯管區活動性炎症(圖2C)，提示該損傷可能由SARS-CoV-2感染或藥物性肝損傷引起的。心肌間質中有少量單核細胞炎性浸潤，但沒有其他心肌實質損害(圖2D)。
流式細胞術發現外周血CD4+和CD8+淋巴細胞數量大大減少，但它們同時也被過度激活。CD4+T細胞中具有高度促炎效應的CCR4+ CCR6+ Th17細胞增加，CD8+T細胞有高濃度的細胞毒性顆粒，其中31.6％的細胞為穿孔素陽性，64.2％細胞為顆粒溶素陽性，30.5％細胞為顆粒溶素和穿孔素雙陽性。結果表明，以Th17的增加和CD8+T細胞的高細胞毒性為表現的T細胞過度活化，能夠部分地解釋患者的嚴重免疫損傷。
COVID-19多數患者發病時症狀較輕，部分患者病情突然加重，關於新冠肺炎嚴重的肺損傷，有學者提出了"細胞因子風暴"(cytokine storm)的理論。即病毒感染機體後機體產生了過多的細胞因子，造成過度反應。細胞因子風暴實際上是一種求助信號，目的是讓免疫系統瞬間快速反應，用自殺式的攻擊並殺傷病毒，但也導致機體血管及器官組織和細胞損傷，血管通透性增強，滲出血液和血漿，這樣的反應能夠觸發免疫系統對自身的猛烈攻擊。細胞因子風暴還會引發一氧化氮的大量釋放，這種物質會進一步稀釋血液並破壞血管。所有這些因素綜合起來，把血壓降到了危險的水平，導致組織缺氧、低血壓、多器官功能障礙和彌散性血管內凝血，因此，
推測細胞因子風暴導致肺及多器官損傷及功能衰竭，可能是COVID-19患者病情突然加重和死亡的主要原因。有了光鏡水平的病理描述和分子水平的細胞因子的證據和推測，美國科學家從更微觀的層面對新冠肺炎病毒做了病原學的研究。
2月11日，美國國家過敏和傳染病研究所落基山實驗室（NIAID-RML）研究者在掃描和透射電子顯微鏡上拍攝了新冠病毒（SARS-CoV-2）的圖像，由視覺醫學藝術辦公室再對圖像進行數字著色，清晰顯示出新冠病毒用來入侵宿主細胞的棘突蛋白。
圖3 新冠病毒電鏡圖像 病毒表面的凸起，看起來就像皇冠
以下圖片中黃色的部分就是導致新冠肺炎的罪魁禍首—— 新冠病毒，多來幾張，加深印象
圖4 新冠病毒電鏡圖像經數字著色
緊接著，又有了更微觀（冷凍電鏡技術）水平的研究，於2月19日，美國德克薩斯大學奧斯汀分校JasonS. McLellan研究組利用冷凍電鏡技術分析了新型冠狀病毒表面S蛋白的近原子結構。另外作者們通過生物物理以及結構方面的證據發現，
SARS-CoV-2的S蛋白結合人體ACE2（宿主細胞受體血管緊張素轉化酶2）的親和力要遠高於SARS-CoV的S蛋白，解釋了新型冠狀病毒傳染性之強的主要原因。為了對新型冠狀病毒的S蛋白預融合的結構進行解析，作者們對蛋白進行了3D結構重組，獲得了3.5 Å分辨率的“向上”蛋白質結構（圖5）。為了接近宿主細胞受體，S1亞基中的受體結合結構域（Receptor-binding domain，RBD）會經歷鉸鏈類似的構象移動用以隱藏或者暴露受體結合的關鍵位點。“向下”結構代表了受體不可結合狀態，而“向上”結構則代表了受體可結合狀態，“向上”結構處於較為不穩定的狀態。
圖5 新型冠狀病毒預融合結構
通過該結構分析，作者們發現S1亞基中的RBD經歷鉸鏈類似運動，此移動特點與SARS-CoV以及MERS-CoV均非常相似，但新型冠冠狀病毒中則RBD結構則更靠近三聚體的中央部位，其S蛋白中3個RBP中的1個會向上螺旋突出從而讓S蛋白形成能夠輕易與宿主受體ACE2結合的空間構象。這個提示新型冠狀病毒的傳染性更強。
將新型冠狀病毒S蛋白的結構與SARS的S蛋白結構進行比較後作者們發現，兩者之間結構最大的不同位於“向下”結構中的RBD結構域(圖6 綠色結構區域)之中。SARS 的S蛋白中“向下”結構中RBD緊貼NTD結構域。雖然存在結構上的不同，但是整體上來說，新型冠狀病毒與SARS-CoV在結構上還是高度相似的。
圖6 新型冠狀病毒與SARS-CoV的結構異同比較
新型冠狀病毒與蝙蝠冠狀病毒RaTG13在S蛋白中序列同源性高達96%，新型冠狀病毒S蛋白中最顯著的變化是具有S1/S2蛋白酶切割位點的“RRAR”（弗林蛋白酶識別位點）氨基酸序列，與SARS病毒中僅具有單個精氨酸不同。
除了在S1/S2連接處的氨基酸殘基差異外，新型冠狀病毒和RaTG13S蛋白還存在29個氨基酸殘基的差異，其中17個位於受體結合的RBD部位。
新型冠狀病毒結合ACE2的親和力要遠高於SARS病毒的親和能力（>10-20倍）（圖7）。這個也進一步解釋了該病毒能夠快速人傳人的原因。
圖7 新型冠狀病毒病毒對於ACE2具有高親和性
SARS病毒的RBD單克隆抗體對新型冠狀病毒的RBD進行交叉反應性測試發現不具有交叉反應。
人體細胞上相應的受體蛋白好比是一把“鎖”，病毒要想進入人體細胞，得有相應的“鑰匙”才能打開。新冠病毒的“鑰匙”是其S蛋白，而ACE2則是病毒入侵的“鎖”。2月18日，西湖大學周強實驗室團隊利用冷凍電鏡技術研究這把“鎖”，他們解析了新冠肺炎病毒的受體——ACE2（血管緊張素轉化酶2）的全長結構。
研究發現，ACE2-B0AT1複合物以“二聚體”形式存在，隨著ACE2的肽酶結構域（PDs）轉移而呈現出“開放（open）”和“關閉（closed）”兩種構象。
由於作為膜蛋白的ACE2本身很難在體外穩定獲得，研究團隊通過共同表達的方法獲得了ACE2與腸道內的一種氨基酸轉運蛋白B0AT1的複合物，並利用冷凍電鏡平臺解析了其三維結構。
受體ACE2-B0AT1複合物：呈現開放和關閉兩種構象
ACE2是一種I型膜蛋白，主要位於肺、心臟、腎臟和腸中，其表達水平與心血管疾病有關。新冠病毒感染後，人體內ACE2水平下降甚至缺失。
圖8 ACE2-B0AT1 複合物的冷凍電鏡密度圖
圖9 ACE2-B0AT1複合物的原子模型
ACE2-B0AT1複合物的原子模型展示，糖基化部分顯示為棒，複合物由亞基著色，ACE2前體中的蛋白酶結構域（PD）和Collectrin樣結構域（CLD）分別為青色和藍色
全長ACE2由一個N末端肽酶結構域（PD）和一個C末端Collectrin樣結構域（CLD）組成，CLD末尾包含單個跨膜螺旋和一個有約40個殘基的細胞內節段
ACE2中的PD負責裂解血管緊張素（Ang）I產生Ang-（1-9），然後被其他酶加工成為Ang-（1-7）。同時，爪狀ACE2-PD的晶體結構還提供了冠狀病毒S蛋白的直接結合位點。
圖10 複合物“開放（open）”和“關閉（closed）”兩種構象
結構比較表明，兩種構象的變化僅通過PD結構域的旋轉而實現，其餘複合物幾乎保持不變。複合物可以同時結合兩個病毒S蛋白，無論是在開放還是關閉狀態下，S蛋白都位於ACE2二聚體的外側。
因此，二聚體ACE2可同時容納兩個S蛋白三聚體，可能存在二聚體ACE2和三聚體S蛋白之間的潛在聚集，這可能對膜的內陷和病毒顆粒的內吞作用很重要，這一過程類似於其他受體介導的內吞作用。
在病毒感染過程中，糖基化起著重要作用。它使病毒粒子具有高度糖基化的表面 ,幫助它們免受人體免疫細胞識別和攻擊。
圖11 ACE2中的糖基化位點，紅色球形為在本研究中發現的
在ACE2-B0AT1複合物的結構中，一共鑑定出7個糖基化位點。這些糖基化位點中，3個位於RBD（受體結合域）結合位點附近。這些糖基化的部分是否直接參與病毒S蛋白與ACE2的結合尚待證實。
有學者推測，新型冠狀病毒利用高度糖基化的同源三聚體S蛋白進入宿主細胞。S蛋白經歷結構變化將病毒融合進入宿主細胞的細胞膜。此過程包括病毒的S1亞基結合到宿主細胞受體上，引發三聚體不穩定性的發生，進而造成S1亞基脫落S2亞基形成高度穩定的融合後結構。
以上這些學者們從不同研究水平（病理光鏡水平、分子水平、電鏡水平及冷凍電鏡水平）對新冠肺炎的發病機制給予了有一定的揭示，也提出了探索，對剖析COVID-19的機制及可能促進潛在臨床治療的發展起到了重要的作用，我們也期待更多的研究。
文末，向奮戰在抗疫一線的所有工作人員們致以崇高的敬意和感謝，也向奮戰在實驗室的研究者們致以深深的敬意，也向全國的同胞們、海外僑胞們及所有幫助我們抗擊疫情的地球村的村民們表示感謝，祝大家健康、平安、幸福！
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