撰文 | 胡小話
當我們在過馬路的時候，路口的交通信號燈會告訴我們：何時可以通過，何時必須停下來。這一準則對於腫瘤細胞來說同樣適用，因為腫瘤的生長和增殖過程同樣受很多上游信號和蛋白所調控，轉錄調控因子NRF2就是其中之一。NRF2被報道在腫瘤的發生發展以及化療抵抗過程中可以調控細胞應激和氧化還原平衡【1】，而它的一個關鍵調控蛋白KEAP1（與Cul3,CAND1共同形成泛素E3連接酶複合體）也被發現在很多癌症類型存在突變。種種跡象表明：NRF2與癌症關係密切。正是因為如此，人們一直寄希望於通過靶向NRF2來干預腫瘤的進程。
Glycation(糖化反應)是指還原性的單糖，比如核糖、葡萄糖以及6-磷酸葡萄糖以非酶促的形式共價結合到蛋白的氨基酸殘基上 (主要是賴氨酸，精氨酸和組氨酸) 形成的一類翻譯後修飾，在食品科學領域也被稱作美拉德反應 (Maillard reaction) 。而它的去修飾則依賴於果糖胺激酶 (Fructosamine-3-kinase,FN3K) ，通過直接磷酸化修飾到蛋白質上的糖基從而使得其不穩定並最終從蛋白上掉下來【2】。值得一提的是，這裡提到的糖化修飾(Glycation)與糖基化修飾 (Glycosylation) 是兩個完全不同的概念 。首先，糖化修飾是由化學性質活潑的還原性單糖自發地與蛋白氨基酸殘基的側鏈發生共價結合而形成的翻譯後修飾，整個過程不需要酶的參與。而糖基化修飾則是在糖基轉移酶作用下將糖類轉移至蛋白質上特殊的氨基酸殘基形成糖苷鍵的過程，這一過程主要發生在內質網和高爾基體，哺乳動物中蛋白質的糖基化類型主要可分為兩種：N-糖基化和O-糖基化。
目前，對於蛋白質糖基化修飾的研究有很多，然而儘管已經找到一些糖化修飾蛋白 (包括血紅蛋白，胰島素以,白蛋白以及組蛋白)【3,4】，例如，Yael David課題組今年3月份在Nature Communications發文報道了組蛋白糖化修飾對於染色質結構影響以及在疾病中潛在調控作用（鄭慶飛博士等揭示組蛋白糖化翻譯後修飾對於染色質結構的影響及其在疾病中潛在的調控作用）【5】，但是關於糖化修飾的生理意義依然有很多值得深入挖掘的地方。
近日，來自紀念斯隆·凱特琳癌症中心的Hans-Guido Wendel教授在Cell雜誌上發表了題為
The Oncogenic Action of NRF2 Depends on De-glycation by Fructosamine-3-Kinase的研究，他們報道了一個新的糖化修飾蛋白NRF2，並且揭示了由FN3K介導的de-glycation調控NFR2蛋白功能的分子機制。
TCGA數據庫顯示，大約15%的肝細胞肝癌患者 (HCCs) 體內NRF2是過度激活的。因此，作者利用CRISPR/Cas9方法在移植瘤的小鼠模型中轉入過度激活的NRF2突變體以及敲除NRF2的抑制因子Keap1，結果顯示腫瘤生長速度與對照組相比顯著增加，並且小鼠的生存時間也明顯下降。這說明NRF2的確是個促癌的蛋白。為了搞清楚NRF2作用位點，作者通過全基因組篩選 (pan-cancer genome-wide SELECT analysis) 的方式發現，在HCCs與NSCLC兩種癌症類型中，NRF2的過度激活與EGFR突變具有很強的相關性。此外，體外實驗表明EGFR的配體EGF和TGFα能通過激活MEK信號通路來誘導NRF2的表達。
緊接著，為了找到在氧化應激條件下NRF2潛在的激活因子，作者構建了一個CRISPR/Cas9 文庫篩選的系統。他們成功找到了幾個可能的調控蛋白，其中包括， Ucp2 (調控線粒體代謝) ，Rasgef1c（Ras-like GTPase），E2f8 (與NRF2和Cul3啟動子直接互作的轉錄調控因子) ，但作者最終將目光鎖定在FN3K，一個被報道可以參與去糖化修飾的蛋白激酶。那麼接下來的實驗順利成章，作者通過一系列生化實驗和質譜學實驗證明，NRF2的確可以發生糖化修飾，並找到了其修飾的關鍵位點。此外，在體內敲低FN3K可以上調NRF2的糖化修飾水平，這說明NRF2的糖化修飾的確受到FN3K調控。那麼，糖化修飾如何調控NRF2的蛋白功能呢？
作者發現，在KEAP1野生型的HepG2細胞中敲低FN3K使得NRF2蛋白的穩定性顯著降低，而在作為對照的KEAP1突變的Huh1細胞中則不受影響，這說明糖化修飾可以調控NRF2的降解。意外的是，作者發現儘管在Huh1細胞中敲低FN3K不會導致NRF2蛋白量的改變，但其功能依然受到影響，即細胞的氧化還原狀態發生了變化。通過進一步的實驗，作者發現FN3K的缺失會抑制NRF2與它的輔助因子small MAF蛋白的相互作用，從而影響NRF2蛋白的功能。至此，作者得出結論：糖化修飾調控NRF2蛋白的活性是以KEAP1依賴和非依賴兩種方式共同存在的。
最後，作者對FN3K調控的NRF2 糖化修飾的生理意義進行了探究。作者發現在HCC模型小鼠中敲低FN3K能顯著延緩腫瘤的生長，而回補NAC (N-acetyl cysteine) 則可以部分恢復腫瘤的生長，這提示糖化修飾除了影響NRF2介導的氧化還原平衡之外，還會通過作用其他靶點來調控腫瘤的生長。的確，利用質譜手段對肝癌細胞的蛋白質組分析，作者一共找到110個由FN3K調控的糖化修飾的蛋白，其中就包括代謝酶LDHA和LDHC，翻譯調控因子eIF4A1,組蛋白H2和H3等，這些都很值得進行更進一步的探究。
綜上，該研究不僅找到了一個新的糖化修飾底物蛋白NRF2，並闡述了由FN3K介導的NFR2去糖化修飾在腫瘤發生發展所發揮的重要功能。同時這項研究也提示我們：對於NRF2過度激活的癌症患者來說，FN3K或許可以作為一個新的干預靶點。除了NRF2之外，作者還找到了很多其他FN3K調控的糖化修飾的蛋白,使得糖化修飾的重要性大大提升。
原文鏈接：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.07.031
製版人：珂
參考文獻
1. Bai, X., Chen, Y., Hou, X., Huang, M., and Jin, J. (2016). Emerging role of NRF2 in chemoresistance by regulating drug-metabolizing enzymes and efflux transporters.Drug Metab. Rev. 48, 541–567.
2. Fortpied, J., Maliekal, P., Vertommen, D., and Van Schaftingen, E. (2006).Magnesium-dependent phosphatase-1 is a protein fructosamine-6-phosphatasepotentially involved in glycation repair. J. Biol. Chem. 281, 18378–18385.
3. Wareham, N.J., and Pfister, R. (2010). Diabetes: glycated hemoglobin is a marker of diabetes and CVD risk. Nat. Rev. Cardiol. 7, 367–368.
4. Hunter, S.J., Boyd, A.C., O’Harte, F.P., McKillop, A.M., Wiggam, M.I., Mooney,M.H., McCluskey, J.T., Lindsay, J.R., Ennis, C.N., Gamble, R., et al. (2003).Demonstration of glycated insulin in human diabetic plasma and decreased biological activity assessed by euglycemic-hyperinsulinemic clamp techniquein humans. Diabetes 52, 492–498.
5. Zheng Q, Omans N D, Leicher R, et al.(2019). Reversible histone glycation is associated with disease-related changes in chromatin architecture. Nature communications,10(1): 1289.
閱讀更多 BioArt 的文章
