美國約翰霍普金斯大學醫學院的Austin K Mattox等在2019年12月的《Neuro-Oncology》雜誌發表文章，闡述腦脊液活檢基因改變、表觀遺傳學表現和蛋白質候選物對CNS腫瘤診治的意義。
——摘自文章章節
【Ref: Mattox AK, et al. Neuro Oncol. 2019 Dec 17;21(12):1509-1518. doi: 10.1093/neuonc/noz156.】
研究背景
腦脊液（CSF）的“液體活檢”可作為中樞神經系統（CNS）惡性腫瘤微創診斷和治療監測的有效途徑。檢測腦脊液中的遊離核酸和生物標誌蛋白為CNS腫瘤的術前診斷、選擇靶向治療和早期發現腫瘤復發奠定基礎。美國約翰霍普金斯大學醫學院的Austin K Mattox等在2019年12月的《Neuro-Oncology》雜誌發表文章，闡述腦脊液活檢基因改變、表觀遺傳學表現和蛋白質候選物對CNS腫瘤診治的意義。
研究方法
“液體活檢”技術利用二代測序（NGS）、質譜（MS）及酶聯免疫吸附試驗（Elisa）檢測腦脊液中游離的無細胞循環核酸DNA和RNA（cell-free circulating nucleic acids，cfDNA和cfRNA）及腦脊液蛋白，獲取基因突變、RNA/miRNA表達譜、差異性甲基化區域（DMR）以及蛋白質表達譜。獲得多時間點的標本對腫瘤進行初步診斷，有助於評估治療反應和腫瘤演變。
研究結果
cfDNA的基因突變：含有典型癌基因和抑癌基因突變的cfDNA來源於腫瘤本身，包含外顯子、內含子和線粒體DNA，其半衰期相對較短，因此是研究腫瘤動態變化的理想對象。在腦脊液中的突變與原發腫瘤中的突變高度一致，高級別腫瘤比低級別腫瘤的腦脊液更容易檢測到突變，而且突變水平更高。相比較，腫瘤大小似乎不能預測突變或突變水平。在腦脊液和血漿中突變的cfDNA濃度比值與腫瘤負荷相關。由於腦腫瘤與腦脊液相毗鄰，提供從腦脊液中檢測腫瘤源性DNA（tDNA）的條件。通過CSF-tDNA的活檢用以診斷和監測CNS腫瘤。檢測CSF-tDNA可識別腦轉移瘤，反映其臨床進程和預測腫瘤復發。檢測CSF-tDNA突變還能確定腫瘤對輔助治療的敏感性。連續的腦脊液活檢可以追蹤腦腫瘤的進展。隨著腦脊液採集間隔時間的延長，編碼生長因子信號通路基因的連續液體活檢，可能改變基因突變的多樣性，特異性也將下降。
cfRNA的表達變化：循環RNA作為cfDNA的替代物有很好的應用前景。cfRNA由循環信使RNA（mRNA）和微小核糖核酸（microRNA，miRNA）組成。mRNA能夠編碼蛋白質，miRNA能夠靶向某個mRNA導致其降解或翻譯抑制。RT-PCR、ddPCR、芯片或RNA測序可以明確目標基因表達水平。前兩者高效直接，成本低廉，但一次只能分析一到兩個基因；後兩者一次能夠分析成百上千個基因。RNA測序可以更好地瞭解標本的RNA表達譜，但耗時、昂貴。循環miRNA可區分原發性CNS惡性腫瘤和腦轉移瘤。mir-15b和mir-21是膠質瘤的特異性miRNA；mir-10b和mir-2155在膠質母細胞瘤（GBM）患者腦脊液中十分豐富；mir-19、mir-21和mir-92a三者是原發性CNS淋巴瘤的診斷指標；miRNA-200變異體具有腦轉移瘤的特異性。
cfDNA甲基化改變：表觀遺傳失調是腫瘤的典型特徵之一。腫瘤細胞整體上低甲基化，位於抑癌基因的啟動子或其它調控元件附近的CPG島顯示不同程度的高甲基化。胞嘧啶甲基化增加產生異染色質區，DNA與組蛋白結合更緊密，無法進行轉錄。高甲基化導致包括抑癌基因在內的基因蛋白表達水平降低。膠質瘤中最常見編碼O6甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶（MGMT）基因的啟動子甲基化，可作為替莫唑胺治療反應的陽性預測因子。cfDNA甲基化狀態與原發腫瘤高度一致。同時研究cfDNA的突變和異常啟動子甲基化，比單獨檢測一種生物標誌物更加敏感。
循環蛋白水平改變：CNS腫瘤向腦脊液分泌或釋放的蛋白質可通過質譜（MS）或ELISA等技術檢測。質譜法能夠從同一標本中檢測出大量不同蛋白質，但技術要求高，價格昂貴。ELISA相對便宜，操作簡單，但僅限於鑑定某些蛋白質。腦脊液中蛋白質升高可能是腫瘤本身、炎症或其它疾病引起。鑑定特異性標誌蛋白更具挑戰性。最重要的特異性腦脊液蛋白是顱內惡性生殖細胞腫瘤的相關蛋白，即β-人絨毛膜促性腺激素（BHCG）和甲胎蛋白（AFP）；在腦脊液中明顯升高時，有助於惡性生殖細胞腫瘤的診斷、治療反應的監測和復發的預測；對於膠質瘤，Shen等確定19種在腦脊液中表達上調的蛋白質；KHuja及其同事篩選出B2M、SPARC1和VEGFB78等；Sampath等發現VEGF在高級別星形細胞瘤中顯著高表達；GBM患者腦脊液中α-1-抗糜蛋白酶、骨橋蛋白、轉氨酶和N-末端白蛋白殘基升高；蛋白質分析可幫助診斷和監測兒童髓母細胞瘤，Rajagopal等發現其腦脊液中前列腺素D2合成酶水平比正常人低6倍。
生物標誌物的侷限性：遊離核酸和蛋白質具有強大的應用潛力，但實驗室中發現的生物標誌物很少能夠應用於臨床，主要障礙可能是相似研究之間的低重複性。此外，生物標本必須妥善保存，避免反覆凍融，以防止降解。測序技術侷限性也阻礙鑑定遊離核酸中少見的突變和甲基化改變。臨床上顱內壓升高是腰椎穿刺獲取腦脊液的重要禁忌證。
結論
最後作者總結，採集腦脊液具有微創性，可提供CNS腫瘤的遺傳基因、表觀遺傳改變和蛋白質組學狀態的圖譜，對腦腫瘤進行初步診斷、預測治療反應和跟蹤腫瘤復發。未來血液檢測可能在CNS腫瘤的診斷和治療中發揮作用，然而血腦屏障可能限制在血液中識別生物標誌物。目前來看，髓母細胞瘤和高級別膠質瘤患者是最好的研究人群，這些腫瘤在突變頻率、CPG島甲基化狀態和蛋白質表達方面的變化最顯著。多時間點收集腦脊液是十分必要的，常規腦脊液取樣已成為一些CNS腫瘤標準治療的一部分；開拓腦脊液診斷技術是現有實踐的邏輯延伸，但需要良好的前瞻性協作研究。
