一、單細胞測序簡介
單細胞測序是指在單個細胞水平上對DNA/mRNA進行擴增與測序的一項新技術。相比於傳統的高通量測序，單細胞測序不僅能夠分析同一組織內細胞間的異質性（如腫瘤細胞、幹細胞），還能實現對數量極少細胞（如神經細胞、生殖細胞）的測序。
從2009年湯富酬老師發表了第一篇單細胞轉錄組測序的文章開始，單細胞轉錄組測序研究越來越火熱，特別是2013年，Science將單細胞測序列為年度最值得關注對的六大領域榜首。
隨即單細胞測序的文章呈現爆發式增長，平均每4篇就有1篇10分以上的高分文章。同時，很多優秀的科學家們都在單細胞轉錄組測序上做出了突出的成績，相繼發表了一系列的方法學文章。比如我們熟知的Smart-seq, Drop-seq等，單細胞轉錄組測序正向著高通量低成本方向發展。
圖1 單細胞轉錄組測序的文章統計
二、高通量單細胞RNA-seq的應用
高通量單細胞RNA-seq指同時對成千上萬個單個細胞進行轉錄組測序，檢測各個細胞的表達和表達情況，從而大大降低了單個細胞的擴增測序成本，推動其在多領域的應用。從課程中列舉的部分2018年高通量單細胞RNA-seq的高分文章可見，高通量單細胞RNA-seq在腫瘤、免疫、幹細胞、神經系統及細胞圖譜等研究領域都有突出的表現。
圖2 高通量單細胞轉錄組測序的應用方向
三、高通量單細胞分離的方法
目前新型高通量單細胞分離技術主要有微孔芯片技術及微流控技術。
微孔芯片技術
是指通過製作孔徑略大於細胞直徑的微孔陣列，通過重力、流體、電場等方式將細胞懸液中的單細胞分離至微孔中的技術，其中作為代表的有WaferGen的ICELL8 Single-Cell System 及 BD的Rhapsody系統。
微流控技術
是指通過微米級別的流道精確操控微升、毫升級別樣品的技術，目前主要有微反應室、微液滴技術。其中微反應室的代表產品有Fluidigm 公司的C1 單細胞自動製備系統；微液滴技術的市場代表產品主要有Illumina聯合Bio-Rad推出的ddSEQ Single-Cell Isolator和10x Genomics公司的Chromium™Controller。目前10x Genomics是通量最高，單細胞細胞成本最低的高通量單細胞分離平臺，以下就重點介紹10x Genomics單細胞RNA-seq的原理及流程。
圖3 高通量單細胞分離平臺
四、10x Genomics單細胞RNA-seq原理及流程
10x Genomics公司的ChromiumTM系統是通過微流體“雙十字”系統，將含有barcode信息的凝膠珠與樣品和酶的混合物混合，然後與油表面活性劑溶液結合，形成油包水的微液滴結構，稱為GEMs。
每個液滴裡包含一個細胞，一個凝膠珠及相應的反應液。磁珠上偶聯40-80萬條oligo，每條oligo上包括22 nt 測序引物結合位點，16 nt 10x Barcode序列，10 nt UMI及30 nt 與mRNA poly A 尾結合的Poly(dT)隨機引物。其中一個凝膠珠對應一種Barcode，用以標記細胞，UMI標記基因並記錄表達量。
圖4 10x Genomics 單細胞捕獲原理
其工作流程是：首先通過消化，洗滌重懸，過濾，細胞計數及活力檢測製備符合要求的細胞樣本，然後，在10x Genomics 平臺的雙十字交叉系統製備油包水的微液滴結構，即GEMs。
GEMs形成後，細胞被裂解，凝膠珠自動溶解釋放大量含barcode，UMI及oligo dT的序列，隨後mRNA逆轉錄產生帶有Barcode和UMI信息的cDNA。隨後油滴破碎，以cDNA為模板進行PCR擴增，然後進行cDNA打斷、加測序接頭P5及測序引物R1等傳統二代測序的建庫過程，得到雙鏈PCR產物。雙鏈PCR產物可以通過質檢後於illumina平臺測序。
同時，華大為了給大家提供更有優勢的測序方案，開發了基於10x Genomics單細胞RNA-seq的測序方案。
首先對PCR產物進行轉換PCR，變性為單鏈，再環化成單鏈環狀DNA文庫，即可用於BGISEQ-500RS或MGISEQ-2000RS平臺測序。測序數據通過10x Genomics提供的Cell RangerTM 分析流程結合轉錄比對數據和標示細胞的barcode信息，進行細胞聚類、差異基因篩選、差異基因功能分析。
圖5 MGI基於10x Genomics平臺的高通量RNA-seq解決方案
五、知識點補充
1.關於樣本製備
a. 製備單細胞懸液：選擇合適的消化酶及消化條件；
b. 洗滌與重懸：推薦使用含有0.04% BSA (400 μg/ml)的 1X PBS 溶液(無Ga、Mg) 清洗、重懸細胞。對於活力敏感類細胞可以選擇10x 推薦的緩衝液或培養基，以確保對後續實驗沒有影響。
c. 細胞過濾：細胞過濾主要是去除細胞團，當細胞懸液體積較小時，推薦使用Flowmi™ Cell Strainer 細胞濾器，可減少樣本損失。
d. 細胞計數及活力檢測：可用臺盼藍染色法檢測細胞活性，用Cell Counter或血球計數板進行細胞計數。若細胞活力檢測時死細胞比例過大，則需用去除死細胞的試劑盒（如MACS® Dead Cell Removal Kit ）去除死細胞，或者重新制備細胞樣品。
製備的細胞樣品要求：
活細胞數在90%以上；細胞濃度在700-1200 cells/µL之間；細胞培養基及緩衝液不能含有Ca2+和Mg2+等影響酶活性的物質等（這裡的樣品要求是10x Genomics平臺的樣本要求，適用於自己建庫的老師，如果是外送服務公司建庫，請參考服務公司的樣本要求）。樣本製備過程應儘量快速，最好在1.5-2h內完成，時間越長對細胞活力影響越大。
2.關於UMI
UMI是“unique multiplex index”的簡稱，是一段10bp的隨機序列，是在mRNA反轉錄時加到反轉錄得到的cDNA上，且因UMI的種類非常多，所以每個細胞內的mRNA結合不同的UMI序列，這樣在經過PCR、再深度測序得到的reads，可以通過UMI判斷哪些reads是來自於一個原始cDNA分子的。
這樣，就可以把起始於一個原始cDNA分子，因為PCR擴增而產生的多個reads，簡併成一個原始的cDNA分子。也就是可以排除因為PCR擴增效率的不同，而導致最後reads數量的偏差，也就是排除“PCR bias”。所以能更準確的定量轉錄本。
3.10x Genomics 單細胞擴增原理
10x Genomics 單細胞擴增是基於Smart-seq（Switching Mechanism at 5’end of RNA Template）的技術原理。製備得到GEMs後，液滴中的反應液會裂解細胞，凝膠珠溶解，釋放的oligo帶有oligo dT序列，與真核生物mRNA 3‘端的poly A結合，進行反轉錄，轉錄到mRNA的5‘端時，繼續合成幾個無模板的C鹼基。反應體系中的5’端為連續G鹼基的Switch oligo與poly(C)結合，然後以Switch oligo為模板繼續延伸，得到兩端均為已知序列的全長cDNA。再用此兩端已知序列設計的引物進行PCR擴增，得到ng級別的雙鏈cDNA產物。所以該方法只適用於帶polyA尾的真核生物mRNA的研究。
圖6 10x Genomics 單細胞轉錄組擴增原理
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