武漢大學王富安教授課題組Chem.Sci.:智能ZIF-8門控聚多巴胺納米平臺用於體內協同增強型聯合光學治療
武漢大學王富安教授課題組合成了一種多功能的ZIF-8門控聚多巴胺納米顆粒（PDAs）載體，並利用其將光敏劑（MB）和過氧化氫酶（CAT）導入腫瘤細胞，實現了協同增強型的光動力-光熱聯合治療。相關成果發表在Chem.Sci.（DOI:10.1039/c9sc06337d）上。
傳統的單模態光動力療法（PDT）或光熱療法（PTT）治療腫瘤效率有限，因此迫切需要開發聯合光學治療策略來應對致死性腫瘤的極端複雜性和異質性。腫瘤血管系統中O2的供應不足，低氧腫瘤組織給藥缺乏特異性，導致光療法對低氧性實體瘤的治療效果不理想。
武漢大學王富安教授課題組合成了一種多功能的ZIF-8門控聚多巴胺納米顆粒（PDAs）載體，可以選擇性地釋放光敏物質並持續生成O2，促進癌症特異性治療，增強光動力-光熱聯合治療效果。作者通過簡單的原位和順序生長法制備了緻密的無機/有機雜化納米體系 PDAs-ZIF-8 （PZ）。ZIF-8的多孔結構在組裝過程中高效地封裝了MB和CAT，從而得到了多功能的PDAs-MB-CAT-ZIF-8（PMCZ）納米顆粒（Figure 1A）。PMCZ在腫瘤酸性pH環境中觸發釋放MB和CAT，催化H2O2分解成O2。有效轉換近紅外光為熱，熱誘導消除癌細胞，顯著提高O2依賴的PDT和聯合光療的效率（Figure 1B）。
Figure 1.A.PMCZ的組裝 B.PMCZ治療原理（圖片來源：Chem. Sci.）
透射電鏡（TEM）和掃描電鏡（SEM）表徵了PDAs和PMCZ的形態（Figure 2A）。PMCZ平均大小比PDAs大20 nm，其直徑變化符合動態光散射（DLS）結果（Figure 2B），表明ZIF-8殼成功組裝在PDAs表面。X-射線衍射(PXRD)結果也證明了ZIF-8的成功沉積，包封MB和CAT對ZIF-8的晶體結構沒有影響（Figure 2C）。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）顯示從PMCZ中提取的CAT的特徵條帶（分子量為60 kDa），驗證了CAT成功包封到PMCZ中（Figure 2D）。
Figure 2.PMCZ的表徵 A.PDAs（a，b）和PMCZ（c，d）的TEM和SEM圖，比例尺：100 nm B.PDAs（P）、PDAs-ZIF-8（PZ）、PDAs-MB-ZIF-8（PMZ）、PMCZ的尺寸分佈 C.ZIF-8、PZ、 PMZ和PMCZ的XRD圖 D.標記物對應蛋白（1）、PMZ（2）、PMCZ（3）和遊離過氧化氫酶（CAT，4）的SDS-PAGE分析（圖片來源：Chem. Sci.）
作者研究了MB的可控釋放效果，將PMCZ納米顆粒置於不同pH值的緩衝液中孵育。MB在pH 7.4時幾乎未釋放，而在pH 5.0時PMCZ有明顯的持續釋放。培養25 h後，15 %和60 %的MB分別在pH 7.4和pH 5.0緩衝液中被釋放（Figure 3A）。在660 nm的光照射下，釋放的MB作為一種高效的PDT光敏劑，產生單線態氧（1O2），激發細胞死亡。在660 nm的光照射下，pH 5.0時，單線態氧檢測試劑DPBF（1,3-二苯基異苯並呋喃）的吸光度下降了80 %。pH 7.4時，DPBF的吸光度下降了50 %，表明在酸性環境增強了1O2生成。同時釋放的CAT可以進一步催化H2O2生成O2（Figure 3B）。作者使用O2探針（[Ru(dpp)3]Cl2(RDPP)）評估了PMCZ引起的H2O2釋放O2的效果， PMCZ 和H2O2共孵育後，RDPP的熒光2 min內淬滅（Figure 3C）。RDPP隨著H2O2濃度的增加而降低，說明生成的O2確實來源於H2O2的分解。作者通過800 nm紫外光照射（2 W cm-1）研究PMCZ的光熱轉換性能，結果顯示PMCZ溶液的溫度隨濃度升高或照射時間增長而升高（Figure 3D）。即PMCZ的光熱轉換性能良好。
Figure 3.PMCZ的MB釋放、O2生成、光動力和光熱性能的體外評價 A.不同pH刺激下PMCZ（50 µg mL-1）釋放的MB隨時間的變化 B.不同處理下不同樣品1O2的生產效率。（1）DPBF（2）DPBF和660 nm輻照（100 mW cm-2）（3）DPBF和H2O2（100 μM）（4）DPBF，H2O2（100 µM）和660 nm輻照（100 mW cm-2）（5）pH 7.4時DPBF和PMCZ（50 µg mL-1）（6）pH 5.0時DPBF和PMCZ（50 µg mL-1）（7）pH 5.0時DPBF、PMCZ（50 µg mL-1）和H2O2（100 µM）
C.這些不同的樣品在不同條件下與RDPP共孵育後的O2生成。（1）H2O2（100 µM）（2）H2O2（100 µM）和PDAs（50 µg mL-1）（3）H2O2（100 µM）和PZ（50 µg mL-1）（4）H2O2（100 µM）和PMZ（50 µg mL-1）（5）H2O2（100 µM）和PMCZ（50 µg mL-1）（6）H2O2（500 µM）和PMCZ（50 µg mL-1）（7）H2O2（1000 µM）和PMCZ（50 µg mL-1） D.不同濃度的PMCZ在808 nm光照下（2W cm-2）的升溫曲線（圖片來源：Chem. Sci.）共聚焦成像研究PMCZ的細胞攝取，經PMCZ處理的細胞的紅色熒光更強（Figure 4A），即HeLa細胞有效地內化了PMCZ。用二乙酸二氯熒光素（DCFH-DA）測定HeLa細胞內ROS的生成。DCFH-DA可被ROS氧化生成二氯熒光素（DCF）（綠色）。660 nm光輻射的HeLa細胞沒有DCF的熒光（Figure 4B），說明這些樣品中沒有產生ROS。PMZ處理的HeLa細胞（Figure 4B）中觀察到強烈的綠色熒光，說明PMZ在激光照射下能夠產生ROS。經CAT包封的PMCZ處理的細胞（Figure 4B），細胞內ROS的表達明顯增加，表明PMCZ釋放的CAT有效促進了ROS生成O2 。為了驗證機制，用RDPP定性評價細胞內O2的產生（Figure 4C）。經PMCZ處理的CAT缺失細胞顯示更強的綠色 ，而RDPP處理的PMCZ組顯示的弱熒光。所有這些都表明，PMCZ可以有效地改善腫瘤的缺氧環境。在體外比較PMCZ + PDT + PTT組、PMCZ + PDT組和PMCZ + PTT組的細胞毒性，顯然PMCZ + PDT + PTT的細胞毒性明顯比PMCZ + PDT組和PMCZ + PTT組低（Figure 4D）。活死細胞染色法觀察不同處理的細胞的凋亡（Figure 4E），流式實驗顯示細胞凋亡數據（Figure 4F），揭示O2能增強PDT效果和聯合光動力治療效果。
Figure 4.納米藥物PMCZ的體外抗腫瘤效果 A.PMCZ（50 µg mL-1）處理HeLa細胞4 h成像 B.HeLa細胞內ROS的CLSM圖像（1）對照（2）腫瘤細胞與660 nm輻照（100 mW cm-2）（3）PMZ（50 µg mL-1）（4）PMCZ（50 µg mL-1）（5）PMZ（50 µg mL-1）+PDT（100 mW cm-2）（6）PMCZ（50 ug mL-1）+PDT（100 mW cm-2） C.不同處理RDPP孵育HeLa細胞4h的CLSM圖像（1）對照（2）PMZ（50 µg mL-1）（3）PMCZ（50 µg mL-1） D.不同濃度的PMCZ和光照射（660 nm，100 mW cm-2 或 808 nm和2 W cm-2）孵育後HeLa細胞的存活率
E.不同處理的鈣調素AM/PI共染HeLa細胞成像（1）對照（2）PMCZ（50 µg mL-1）（3）PMCZ（50 µg mL-1）+ PDT（660 nm，100 mW cm-2）（4）PMCZ（50 µg mL-1） + PTT（808 nm，2 W cm-2）（5）PMCZ（50 µg mL-1）+ PDT（660 nm, 100 mW cm-2）+ PTT（808 nm，2 W cm-2）比例尺50 µm F.流式分析不同處理的Annexin V 和 FITC-PI處理的海拉細胞完整的海拉細胞（1）對照（2）PMCZ（50 µg mL-1）（3）PMCZ （50 µg mL-1） + PDT （660 nm， 100 mW cm-2）（4）PMCZ（50 µg mL-1） + PTT（808 nm，2 W cm-2）（5）PMZ（50 µg mL-1）+ PDT（660 nm，100 mW cm-2）+ PTT（808 nm，2 W cm-2）（6）PMCZ（50 µg mL-1）+ PDT（660 nm，100 mW cm-2）+ PTT（808 nm，2 W cm-2）比例尺50 µm（圖片來源：Chem. Sci.）作者進一步研究了PMCZ在體內的效果，首先研究了光熱治療效果，PMCZ處理的腫瘤在2 min內快速升到45度，足以殺傷細胞，而對照組變化不大，證明了其光熱治療的可行性（Figure 5A）。PBS或PMCZ處理小鼠腫瘤都生長迅速，說明僅PMCZ處理對腫瘤生長無影響。相比之下，PMCZ + PDT或PMCZ + PTT組對腫瘤生長有中度抑制作用，但仍不能完全抑制腫瘤增長。PMCZ + PDT + PTT組腫瘤完全被抑制（Figure 5B and 5C）。PMCZ + PDT + PTT組療效顯著高於對照組CAT缺失的PMZ + PDT + PTT組，歸因於PMCZ誘導缺氧改善PDT在腫瘤缺氧微環境中的作用。蘇木精和伊紅(H&E)染色和原位終末脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP刻痕末端標記對腫瘤不同處理的抑制效果進行評估（Figure 5E），PMCZ + PDT + PTT組合療法導致癌細胞凋亡最多。組織成像顯示PMCZ + PDT + PTT組腫瘤組織表現出嚴重的核破壞（Figure 5F）。這些結果證實PMCZ 在腫瘤缺氧的微環境中促進O2的產生。
Figure 5.納米藥物PMCZ的體內抗腫瘤作用 A.808 nm光照射（1 W cm-2）不同處理小鼠的熱紅外圖像a.PBS（50 µL）b.PMCZ（50 µL，800 µg mL-1）B.不同處理小鼠的相對腫瘤體積生長曲線和 C.腫瘤重量 D.每次不同治療結束時從荷瘤小鼠身上收集的腫瘤 E.H＆E和F.TUNEL染色圖像從不同治療組抗腫瘤研究（1）PBS （50 µL）（2）PMCZ（50 µL，800 µg mL-1）（3）PMCZ（50 µL，800 µg mL-1）+ PDT（660 nm， 1 W cm-2）（4）PMCZ（50 µL，800 µg mL-1）+ PTT（808 nm，1 W cm-2）（5）PMZ（50 µL，800 µg mL-1）+ PDT（660 nm，1 W cm-2）+ PTT（808 nm，1 W cm-2）和（6）PMCZ （50 µL，800 µg mL-1） + PDT（660 nm，1 W cm-2）+ PTT（808 nm，1 W cm-2）比例尺：100 µm（圖片來源：Chem. Sci.）
總結：武漢大學王富安教授課題組通過簡單的原位和順序生長法制備了緻密的無機/有機雜化納米體系 PDAs-ZIF-8 （PZ）。並利用其將光敏劑（MB）和過氧化氫酶（CAT）高效地封裝（PMCZ）導入腫瘤細胞，PMCZ在腫瘤酸性pH環境中觸發釋放MB和CAT，催化H2O2分解成O2。有效轉換近紅外光為熱，熱誘導消除癌細胞，顯著提高O2依賴的PDT和聯合光療的效率。這種多模式治療和無機/有機雜化納米體系，為提高腫瘤治療療效提供了新的思路。作者的研究揭示了聯合光療的有效整合，拓寬了基於智能協同治療的癌症診斷和立即給藥的範圍。
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