蒽環黴素，諸如多柔比星(doxorubicin)，是一類目前臨床上被廣泛應用於多種癌症治療的有效藥物。然而由於蒽環黴素本身具有很強的心臟毒性，臨床稱之為“蒽環黴素誘導心臟毒性”（anthracycline-induced cardiotoxicity, AIC），很多接受了蒽環黴素治療的癌症病人在癌症症狀得以緩解的同時卻誘發了嚴重心肌病，甚至導致心力衰竭和死亡【1】。據估計，被診斷出AIC的癌症病人兩年的死亡率約在50%左右【2】。因此，尋求有效的AIC治療方法是癌症領域和心血管領域共同且迫切的研究方向。
另一方面，AIC的發病在人群中表現出了極強的個體差異，也給AIC的預防和治療都帶來了更大的難度。不同的癌症病人在接受了相同劑量的蒽環黴素治療後表現出的AIC發病與否，發病時間和發病程度都不相同。由此推斷，在人的基因組上存在AIC症狀的修飾基因，而個體基因差異可以在很大程度上會影響AIC的發病。然而目前對這些潛在的修飾基因認識非常有限，如何快速找出這些潛在的AIC修飾基因，以及如何針對這些基因設計療法，都成為了研究的難點。
來自美國明尼蘇達州梅奧診所的徐曉雷教授研究組，多年致力於心血管疾病的遺傳學研究。2011，他們首次通過腹腔注射與臨床相關的高劑量多柔比星，在成年斑馬魚上建立了AIC研究模型（Ding，et al， Circulation Research，2011）【3】。同年，徐曉雷團隊與合作者一起利用“基因斷裂轉座子”（gene-break transponson, GBT）系統，在斑馬魚中建立了全基因組系統性基因敲除平臺（Clark，et al，Nature Methods，2011）【4】。不同於普通的基因突變，每一個GBT斑馬魚系：（1）有且只有一個基因被突變；（2）被突變的基因被紅色熒光所標定；（3）每個突變都可以被系統性或者條件性地回覆。2016，徐曉雷團隊開創性地將成年斑馬魚AIC模型和GBT系統相結合，建立了高效的AIC修飾基因篩查平臺，首次實現了以正向遺傳學為基礎對AIC修飾基因在基因組水平上的系統性鑑定（Ding，et al，JCI insight，2016）【5】。通過對609個不同的GBT突變系的篩查，發現了四個全新的AIC修飾基因，其中三個基因的突變導致AIC病症的惡化，而另一個基因（發現於編號為GBT0419的魚系），retinoid X receptor alpha （RXRA），的突變使得斑馬魚對AIC產生了保護作用。
近日，徐曉雷教授研究組在Science Advances上在線發表題為“Retinoid X receptor alpha is a spatiotemporally predominant therapeutic target for anthracycline-induced cardiotoxicity”的研究論文。該研究對以RXRA為基因靶標的AIC療法的分子機制和細胞學機制進行了深入闡釋，揭示在心肌內皮細胞上特異性激活RXRA基因功能可以有效地改善AIC症狀。該研究報道了兩種RXRA激活劑，異維甲酸和貝沙羅汀，可潛在應用於對AIC的早期階段的治療。
徐曉雷團隊前期的工作已經證實GBT0419魚系（帶有RXRA有益突變，位於斑馬魚通源基因rxraa）可以顯著降低成年斑馬魚AIC模型的長期病死率5。在此項研究中，基於GBT突變系的可回覆性，研究人員首先利用多種CreER－loxP組合在組織學水平上對此RXRA有益突變的有效細胞類型進行定位 （圖 1）。通過在心臟內皮細胞（利用kdrl：CreER魚系），心肌細胞（利用cmlc2:CreER魚系）和心臟外皮細胞（利用tcf21:CreER魚系）分別對此突變實現特異性回覆，研究者發現只有在心臟內皮細胞上的突變回復才會讓該魚系失去對AIC的保護作用。
當有益突變在心臟內皮細胞被回覆後，GBT0419魚系在AIC模型上的表現為病死率升高，心功能降低，以及運動能力變差。與之相反，在心肌細胞和心臟外皮細胞上對RXRA有益突變進行回覆，均不影響GBT0419魚系對AIC的保護作用。由此證明，GBT0419所攜帶的RXRA有益突變主要是在心臟內皮細胞上發揮AIC保護作用，而在心肌細胞和心外皮細胞上的作用相對而言並不重要。
圖1 只有在心臟內皮細胞（kdrl+）特異性地將RXRA有益突變進行回覆，可以影響GBT0419魚系對AIC的保護作用
研究者進一步探討GBT0419上所帶突變是屬於RXRA的功能獲得性 （gain-of function）還是功能缺失性（loss-of function）突變。他們首先利用了TALEN基因編輯技術建立了一個rxraa基因缺失魚系作為對照。與GBT0419魚系不同，RXRA基因缺失魚系不但沒有對AIC的保護作用，反而有比野生型更高的病死率和更為嚴重的心肌病病理變化，具體表現為心肌細胞凋亡增多，心功能降低，心衰指標上升，以及肌小結結構破壞更嚴重等。
這一結果提示GBT0419上所帶突變並非RXRA功能缺失性突變。另一方面，研究者通過RNA水平表達量的測定，發現在GBT0419中rxraa自身的mRNA水平上升，且與之相關的視黃酸通路的靶標的表達水平也有所上升。同時，用視黃酸通路的抑制劑對GBT0419進行長期干預也可以降低其對AIC的保護作用。由此證明，GBT0419魚系所帶的RXRA有益突變更像是一種功能獲得性突變，其帶來的對於AIC的心臟保護在一定程度上是通過激活了視黃酸通路而實現的。
研究者隨後又從另一方面對此推斷進行驗證 。他們通過轉基因技術建立了rxraa基因的條件過表達魚系。利用之前提到的kdrl：CreER，cmlc2:CreER和tcf21:CreER三個魚系，研究者分別將rxraa在心臟內皮細胞，心肌細胞和心臟外皮細胞進行了過表達（圖2）。通過後續實驗，研究者直接地證明了rxraa的功能獲得性改變會對AIC產生保護作用。與之前結果一致，研究者發現相對於心肌細胞和心臟外皮細胞而言，將rxraa過表達於心髒內皮細胞可以最有效地降低AIC模型的病死率，提高其心功能和運動能力。
圖2 RXRA斑馬魚同源基因（rxraa）在心肌細胞（cmlc2+）和在心臟內皮細胞（kdrl+）的過表達系統
緊接著，研究者開始尋找以RXRA為靶點的AIC潛在治療藥物。先是利用一個高通量的胚胎斑馬魚AIC模型【6】對已商品化的RXRA激活劑進行了藥物初篩，找到了三個可能對AIC起心臟保護的激活劑。針對其中兩個已經被FDA批准上市的藥物，異維甲酸和貝沙羅汀，研究者在成年斑馬魚AIC模型中進行了進一步驗證。他們根據AIC模型的疾病表型的不同劃分了三個不同的給藥階段：多柔比星注射前1周（預防階段），多柔比星注射後1-4周（早期階段，心功能無明顯變化）和多柔比星注射後5-8周（晚期階段，心功能出現明顯下降）。通過對病死率和對心功能的檢測，研究者發現相對於另外兩個階段，在早期階段用異維甲酸或貝沙羅汀對AIC模型進行干預，可以達到最好的治療效果。
最後，研究者對於以RXRA為靶點的AIC療法在心臟內皮細胞和早期病發階段的特異性從機制上給出了一種解釋。通常情況下，多柔比星等蒽環黴素進入人體後會隨著血液循環到達心臟，並通過破壞或穿透由心血管內皮結構構成的保護屏障到達心肌細胞，造成心肌細胞凋亡而誘發心肌病
【7】。而心血管內皮的屏障功能主要是通過心臟內皮細胞間的緊密相連實現的。研究者發現用多柔比星對體外培養的人冠狀動脈的內皮細胞進行處理會造成參與緊密連接（tight junction）結構之一的蛋白ZO－1（由TJP1基因編碼）表達水平降低，而同時加入RXRA激活劑可以相反的促進ZO－1的表達。通過分離成年斑馬魚AIC模型的心臟內皮細胞，研究者也發現RXRA激活劑可以在促進TJP1斑馬魚同源基因在RNA水平上的表達。通過對成魚心臟切片進行免疫熒光染色，可以看到在AIC模型早期由內皮細胞Zo－1蛋白形成的規律網狀結構被破壞，而同時期利用RXRA激活劑進行干預則可以抑制這種結構變化。類似的現象也在體外培養的人內皮細胞中得到證實。最後研究者利用了一個體外細胞滲透實驗進一步證明了RXRA激活劑可以提升人內皮細胞對多柔比星的屏障作用（圖3）。
圖3 在早期AIC病理變化中，RXRA激活劑可以通過調節ZO-1蛋白的功能而降低多柔比星對心臟內皮細胞的穿透性
總體來說，這項工作報道了RXRA可以作為有個有效的AIC治療靶點，並提示後對以RXRA為靶點的AIC療法研究和轉化工作需要考慮其療效在時間上和空間上的雙重特異性，為隨後的基因精準療法打下基礎。同時這也是第一個通過正向遺傳學手段發現的AIC基因治療靶點。
本文的第一作者梅奧診所博士生馬瀟介紹：“我們希望能夠為AIC病人找出儘可能多的可行的治療靶點，同時也希望充分得利用模式生物中的一些前沿技術來促進這些發現往臨床上的轉化的可能。很多時候，藥物或療法的臨床使用不僅要知道原理，還需要知道最合適的干預部位和干預時間，從而使得療效最大化同時避免副作用。這裡我們用斑馬魚對RXRA的研究方式可以應用於更多後續發現的AIC修飾基因，在尋找新治療靶點的同時為其在臨床上的準確，或者說正確，應用提供思路。”
本文的通訊作者徐曉雷教授也向我們介紹：“斑馬魚作為一種高通量的遺傳學模式生物，可以很好的服務於心血管疾病的個體化醫療研究。我們將把這裡提到的正向遺傳學篩選平臺與人類全基因組關聯研究（GWAS）手段相結合，系統篩查AIC修飾基因，發展相關療法，並將類似的方法應用與其他心血管疾病的基因研究中。”
本文的合作單位包括加州大學洛杉磯分校（UCLA），長沙湘雅二院，北京安貞醫院和北京中醫藥大學。
原文鏈接：
https://advances.sciencemag.org/content/advances/6/5/eaay2939.full.pdf
製版人：小嫻子
參考文獻
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5. Ding, Y., Long, P. A., Bos, J. M., Shih, Y. H., Ma, X., Sundsbak, R. S., ... & Wang, J. (2016). A modifier screen identifies DNAJB6 as a cardiomyopathy susceptibility gene. JCI insight, 1(14).
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7. Wilkinson, E. L., Sidaway, J. E., & Cross, M. J. (2016). Cardiotoxic drugs Herceptin and doxorubicin inhibit cardiac microvascular endothelial cell barrier formation resulting in increased drug permeability.Biology open, 5(10), 1362-1370.
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