導讀
病理診斷一直是淋巴瘤診斷的重要手段。而從事病理診斷的同仁們可能有注意到，在2018版的中國惡性淋巴瘤診療規範中，相比於2015年的版本，將流式細胞術列入其中，作為淋巴瘤診療中常規病理學診斷的有益補充。對於這一變化，我們應該如何理解？今天，北京博仁醫院醫學檢驗科流式細胞實驗室的喻新建主任為我們來解惑流式細胞術在淋巴瘤整合診斷中的作用。
問：流式技術相比於常規病理技術而言，有哪些優缺點？
流式檢測技術與常規病理技術相比，有明確的優缺點。優點方面：相比病理1-2周才能出結果，流式免疫分型報告一般在1-2天內即可出具；流式操作整體流程比較簡單，組織處理標記後即可上機檢測；採用單克隆熒光抗體標記不同的細胞膜和胞內蛋白，特異性好，結果判讀受人為主觀因素影響小於病理技術；每次檢測細胞數量大，靈敏度高，可達到10^-3~ 10^-5。
當然，流式檢測淋巴瘤標本也有其缺點：流式標本處理會破壞組織，不能保持正常結構；對於胞漿和胞核標記存在困難，一些指標比如Bcl-2、Cyclin-D1等的檢測欠佳；標本無法像病理診斷一樣長期保存以作後續分析；某些疾病或細胞類型意義有限：霍奇金淋巴瘤，骨髓增殖性腫瘤（MPN），巨核細胞等。
從檢測標本類型來看，流式檢測通常是採用液體的細胞標本，比如外周血、骨髓穿刺標本及胸腹水、腦脊液等。組織活檢標本和細針穿刺標本多送往病理診斷。實際上，這些組織標本包括骨髓活檢標本也可以通過適當處理，成為適合流式檢測的液體樣本。因此在需要流式技術輔助淋巴瘤診斷時，臨床醫生可以多嘗試組織樣本的送檢。
問：除了淋巴瘤的檢測之外，我們在臨床工作中還可以通過流式細胞術進行哪些檢測？
流式檢測技術的適用領域很廣，在臨床血液學中我們還可以通過其進行微量殘留腫瘤細胞（即微小殘留病，MRD）檢測，淋巴細胞亞群的分析，NK細胞/CTL細胞顆粒酶、穿孔素檢測，CD34+細胞計數，PNH檢測：CD55/CD59和FLAER，非造血系統腫瘤骨髓轉移和腫瘤細胞DNA倍體分析等。在血液學之外，流式細胞術也可以應用於其他的檢測，例如通過檢測HLA-B27來進行強直性脊柱炎的診斷等。
問：在淋巴瘤的流式診斷中，我們可以參照哪些標準呢？
我們通常可以參考的標準包括：
WHO血液和淋巴系統腫瘤分類（WHO2016）
國際和國內工作組制定的診斷標準，指南，專家共識
比如2017《流式細胞學在非霍奇金淋巴瘤診斷中的應用專家共識》提出了流式檢測技術可以明確診斷的病理類型，如急性淋巴細胞白血病/淋巴母細胞淋巴瘤（ALL/LBL）、慢性淋巴細胞白血病/小淋巴細胞淋巴瘤（CLL/SLL）、毛細胞白血病（HCL)、漿細胞腫瘤(PCN)、T大顆粒淋巴細胞白血病（T-LGLL）、 NK細胞-慢性淋巴增殖性疾病（NK-CLPD）、成人T細胞白血病/淋巴瘤（ATLL）等。以及能起到輔助診斷作用的部分病理類型，主要是指免疫表型不具有特異性，或具有特定遺傳學異常的淋巴瘤類型，常見的有:邊緣區淋巴瘤（MZL）、濾泡淋巴瘤（FL）、幼淋巴細胞白血病（PLL）、套細胞淋巴瘤（MCL）、淋巴漿細胞淋巴瘤/華氏巨球蛋白血癥（LPL/WM）、Burkitt淋巴瘤（BL）、肝脾T細胞淋巴瘤（HSTCL）、蕈樣黴菌病/Sezary綜合徵、非特指型外周T細胞淋巴瘤（PTCL，NOS）和血管免疫母細胞T細胞淋巴瘤（AITL）。
問：能具體向大家介紹一下流式細胞術如何實現淋巴細胞分化與抗原表達檢測嗎？
和白血病的流式免疫分型相似，流式是根據淋巴細胞的表型異常來診斷各類淋巴瘤。細胞免疫表型異常主要有以下幾種情形：①抗原表達強度改變：過強，減弱或丟失②系列不保真：同時表達其它系列標誌（跨系）③非同步表達：不同成熟階段的抗原同時表達 ④罕見的細胞明顯增多⑤FSC，SSC改變。
圖一
圖二
如圖一、圖二所示，不同分化階段的B細胞具有不同類型和強度的抗原表達，在流式分析圖上也會呈現出不同的分佈。於是我們通過檢測送檢組織的抗原表達分佈情況可以判斷出細胞的類型和發育程度。
圖三
T細胞成熟於胸腺，目前對其各階段的抗原表達特徵及強度也有比較明確的認知，可作為流式檢測的判斷依據，如圖三所示。
對於成熟淋巴細胞克隆性判斷的依據主要為：
B淋巴細胞：胞膜Ig輕鏈Kappa，Lambda
T淋巴細胞：TCR Vβ。輔助判斷可參考 CD4:CD8，TCRαβ，TCRγδ
NK細胞：CD158系列(KIR)
漿細胞：胞漿Ig輕鏈Kappa，Lambda
問：從剛才的介紹中我們可以看到免疫分型在流式分析中非常的重要，其意義主要有哪些呢？
流式分析可以幫助我們區分良性(反應性增生)和惡性細胞；判斷惡性細胞的系列來源和分化階段；也可以通過CD7，CD56， ZAP70等Marker輔助判斷疾病的惡性程度及預後；此外，免疫分型還可以幫助我們選擇適合的治療靶點，如CD19、CD20、CD22、CD38、BCMA，這對於細胞治療等新興的應用來說是至關重要的。
問：能和大家分享一些流式檢測診斷淋巴瘤的案例嗎？
以下為兩個我們在實際工作之中遇到的淋巴瘤案例
圖四
案例一：圖四中的檢測結果來自於患者的骨髓樣本，通過流式分析我們可以看到，樣本FSC較大， CD19、CD20、CD22、CD79b陽性，CD3、CD23、FCM7陰性，胞膜Ig輕鏈限制性表達Lambda。考慮為瀰漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)。
圖五
案例二：在分析圖中我們可以看到，該患者CD38、CD138陽性，不表達CD19和CD27，異常表達CD56，還有胞漿Lambda的限制性表達，因此可診斷為漿細胞腫瘤(PCN)。
喻新建 主任
北京博仁醫院醫學檢驗科流式細胞實驗室主任，北京醫科大學醫學博士，德國烏爾姆大學(Universität Ulm)博士後。
有20多年血液病臨床、實驗診斷工作及研究經驗。曾先後在大連醫科大學、北京大學人民血研所、德國烏爾姆大學等從事血液臨床、實驗室診斷及研究。
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