活性氧（ROS）是由氧的不完全還原形成的分子家族，包括超氧陰離子（O2•-），過氧化氫（H2O2），羥基自由基（•OH）。ROS代謝產物廣泛存在於癌症、神經退行性疾病和心血管疾病等各種疾病中。由於細胞代謝改變，ROS（特別是H2O2）的過度表達是癌細胞的標誌。癌症治療利用氧化還原化學來促進細胞內H2O2轉化為•OH，因此僅在癌細胞內產生強力的氧化損傷，從而抑制癌細胞的增殖。目前，研究人員開發出大量的納米催化藥物可以在癌細胞中引發芬頓反應，將H2O2歧化成高毒性的•OH，從而瞬間氧化損傷細胞蛋白和細胞器。但是，由於癌細胞的自噬機制可以減輕氧化損傷，這種機制損害了治療效果。
近日，中國科學院上海硅酸鹽研究所施劍林院士、陳雨教授課題組通過模擬過氧化物酶製備了一種含鐵的金屬有機骨架[MOF(Fe)]納米催化劑，採用抑制自噬策略來增強活性氧誘導的氧化損傷，用於協同治療癌症。相關論文以” A Metal-Organic Framework (MOF) Fenton Nanoagent-Enabled Nanocatalytic Cancer Therapy in Synergy with Autophagy Inhibition”為題，發表在《Adv. Mater.》上。【本文亮點】
（1）採用抑制自噬策略來增強活性氧誘導的氧化損傷，用於協同治療癌症。
（2）通過模擬過氧化物酶製備的[MOF(Fe)]納米催化劑，在癌細胞內催化高氧化性•OH的生成，其中氯喹用於脫酸溶酶體和抑制自噬，切斷嚴重氧化應激下的自我保護途徑。
（3）在納米催化治療過程中，癌細胞無法通過提取其成分來解毒和增強自身功能，最終屈服於ROS誘導的氧化損傷。
（4）體外和體內實驗證明納米催化治療和自噬抑制之間具有協同作用，這種聯合策略可用於放大腫瘤特異性氧化損傷。
【圖文解析】要點1 納米催化劑[MOF(Fe)]的設計和治療機理
作者提出了一種利用藥物調節劑同時抑制自噬和增強納米催化腫瘤治療的聯合治療方法。氯喹是一種經典的自噬抑制劑，在臨床上廣泛應用於抗瘧疾。因此，聯用氯喹和納米催化藥物可效地阻斷自噬進而殺死癌細胞（方案1）。這種聯用策略不僅可以顯著加重長期的副作用，而且還會導致嚴重的代謝缺陷。癌細胞未能提取其成分以解毒並增強自身，最終屈服於治療干預。為了保證足夠量的•OH，具有過氧化物酶樣活性的納米級MOF材料NH2-MIL-88（Fe）已被選擇作為一種高效的納米催化藥物，以觸發整個治療過程。體內外實驗結果表明，這種聯合治療方法具有顯著的抗腫瘤作用。
要點2 表徵納米藥物NH2-MIL-88B理化性質作者通過TEM、高角度環形暗場SEM表徵了NH2-MIL-88B (Fe)納米粒子的高分散性及其雙錐六角形稜柱的形態（圖1a–b）。EDS表明Fe，Cl，N，O在納米顆粒上的均勻分佈 (圖1 c)，而XPS進一步證明金屬羧酸鹽的所有鐵原子都處於三價態 (圖1d-e)。FTIR在1156- 1096 cm-1處的吸收帶(圖1f)證明了Pluronic F127在NH2-MIL-88 (Fe)上的存在。XRD圖譜與結晶學數據相符合（圖1g)。每個八面體的Fe原子可以作為催化中心，賦予NH2-MIL-88 (Fe)在酸性環境中類似過氧化物的活性(圖1h)。為了確定催化NH2-MIL-88（Fe）功能， 利用ESR捕獲處理後的•OH，結果表明，加入H2O2可觀察到1:2:2:1的•OH特徵信號，而沒有H2O2時則沒有信號(圖1i)，說明Fe具有較高的催化活性和敏感性。受酶學研究方法的啟發，通過測定NH2-MIL-88 (Fe)的米氏穩態動力學（Michaelis-Menten），對其催化性能進行了研究。作者利用TMB用於時間歷程比色檢測催化反應生成的•OH，監測和繪製在652 nm處的吸光度變化（圖1j），然後根據比爾-朗伯定律，進一步繪製Michaelis-Menten曲線（圖1k）。為了確定Vmax和Km，Lineweaver-Burk擬合也由線性雙倒數變換繪製（圖1l）。結果表明其可以與辣根過氧化物酶的催化活性相媲美，進一步證明NH2-MIL-88（Fe）在催化H2O2轉化成•OH中的高效率，即使在癌細胞的嚴格細胞內環境中也是如此。綜上，作者利用TEM、SEM、EDS、XPS、FTIR、XRD驗證了MOF(Fe)的成功製備，然後利用ESR說明MOF(Fe)具有較高的催化活性，最後模擬酶學研究方法證明MOF(Fe)在催化H2O2轉化成•OH中的高效率。
圖1 納米藥物NH2-MIL-88B的表徵。
要點3 納米催化藥物產生•OH
為了檢驗MOF (Fe)、CQ和它們的組合的治療效果，作者首先對細胞氧化還原狀態進行研究。結果表明，與對照組相比，氧化的DCFH-DA（DCF）中沒有發現明顯的綠色熒光，在MOF（Fe）和協同治療組中都能觀察到DCF的顯著熒光信號，表明MOF（Fe）顯著提高細胞內•OH含量（圖2a）。CQ組DCF信號輕微增強，表明CQ的藥理活性可能與氧化應激的增強間接相關。然後，為了進一步驗證細胞催化機制，作者通過流式細胞儀和免疫印跡進行驗證。通過流式細胞術，用DCFH-DA處理後•OH的丰度具有顯著的變化，表明MOF (Fe)的引入可以消除氧化還原的穩態，提高氧化應激水平 (圖2b)。 免疫印跡中SOD1和GPX4的表達在MOF (Fe)和協同治療組中均顯著上調，表明這是MOF (Fe)催化•OH生成引發內源性負反饋調節機制的結果(圖2c)。這些結果表明，細胞內氧化還原狀態與自噬反應的下游作用密切相關。
圖2納米催化藥物產生•OH
要點4 納米催化藥物和氯喹調控自噬
為了進一步探討氧化還原調節和自噬之間的關係，評估了低濃度的MOF (Fe)、CQ和它們的組合對自噬通量的影響。在MOF (Fe)、CQ和它們的組合組中可以觀察到不同的自噬相關蛋白GFP-LC3B斑點(圖3a)，表明自噬體的數量在這些治療後增加。進一步使用bio-TEM來評估未轉染GFP-LC3B pcDNA的A375和HeLa細胞在發育階段的自噬通量(圖3b)。對照組細胞自噬初期和降解性空泡較少，說明細胞處於典型的自噬過程中。在MOF (Fe)、CQ和它們的組合組中觀察到更多的AVi，這與圖3a觀察結果一致，表明這些治療可能有利於自噬體的形成和積累。免疫印跡證明CQ對自噬抑制的作用與MOF（Fe）對催化•OH的產生協同作用（圖3c），防止受損細胞成分的降解和體內穩態的正常化，促進納米催化療法誘導的氧化損傷的增加。
圖3 納米催化藥物和氯喹對自噬的調控
要點5 納米催化藥物和氯喹協同治療誘導細胞凋亡
作者通過細胞活性來評估MOF（Fe）和CQ之間的協同作用進行了進一步的研究。分別用MOF (Fe)、CQ和它們的組合來處理A375、HeLa和HUVECs細胞，用CCK-8分析量化其有效性（圖4a-e）。結果表明， CQ處理對細胞活力有輕微影響，而MOF（Fe）由於其固有的過氧化物酶樣活性而顯示出一定程度的細胞毒性，從而促進細胞內•OH生成。隨著MOF（Fe）和CQ濃度的增加，組合療法的具有更強的細胞毒性，效協同效應可以觀察到高度的實質性。由於HUVECs中過氧化物酶底物H2O2的缺乏，所以MOF（Fe）或它們的組合對HUVECs活力的影響可忽略不計。
隨後，通過免疫印跡進一步研究了細胞死亡的潛在分子機制（圖4g-l）。Caspase 3在A375和HeLa細胞的聯合治療組中被顯著激活，證實了協同治療後癌細胞的凋亡途徑。裂解聚腺苷酸聚合酶（C-PARP）廣泛參與細胞應答。在HUVECs協同治療組中觀察到C-Cas3和C-PARP的表達無明顯變化，證實了MOF（Fe）對腫瘤的H2O2響應性催化反應的協同作用的高特異性，這使得只有在癌細胞中產生高毒性的•OH。
要點6 納米催化藥物和氯喹體內協同抗腫瘤作用
最後，作者建立腫瘤移植模型對體內協同抗腫瘤作用進行評價。MOF（Fe）和CQ聯合應用可顯著抑制A375和HeLa腫瘤異種移植物的生長，但MOF（Fe）和CQ組均未抑制（圖5a、b、d、e）。此外，聯合治療組小鼠的Kaplan-Meier生存曲線顯示，協同治療後腫瘤異種移植物顯著退化，延長了小鼠的壽命（圖5c、圖5f）。腫瘤切片的免疫組化檢測表明，MOF（Fe）引發局部氧化損傷和下游自噬反應，CQ阻止有毒的自噬底物的處理，協同治療可通過自噬抑制提高氧化應激，阻斷癌細胞固有的解毒途徑，最終導致腫瘤退行（圖5g）。
【小結】
綜上，作者將納米催化治療與藥物自噬抑制相結合增強腫瘤的氧化損傷。MOF (Fe)作為一種過氧化物酶模擬物，可以催化腫瘤組織內•OH的生成，而CQ可以降解溶酶體，抑制自噬，阻斷癌細胞在嚴重氧化應激下的自我保護途徑。體外和體內實驗證明了納米催化治療和自噬抑制之間的協同作用，表明這種聯合策略是有效的，可能對未來的治療模式設計具有指導意義。通過合理管理化療干預下的癌細胞自噬過程，有望在未來取得更大的醫學進展。
原文鏈接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1002/adma.201907152
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