劉兵合作團隊利用誘導多能幹細胞實現T細胞免疫再生

T 細胞是一類執行獲得性免疫功能的免疫細胞，在機體抗腫瘤、抗病毒感染等方面發揮重要作用。近年來，根據T細胞的細胞毒性原理的臨床免疫療法（如CAR-T, TCR-T）成為治療惡性腫瘤的新手段，部分腫瘤患者經治療後病情得到緩解甚至治癒，病人生存、生活質量得到顯著改善。然而，廣大腫瘤患者自身的T細胞常見功能異常或者耗竭，阻礙了這一療法的廣泛應用，因此迫切需要獲得廣譜、無限來源的新型T細胞。隨著製備病人體細胞來源的誘導型多能幹細胞(iPSC)技術的日臻成熟，通過誘導iPSC向T細胞免疫譜系分化成為獲得無限來源T細胞的關鍵技術路徑。

圍繞T細胞體外再生，科學家從模擬T細胞胸腺發育微環境和關鍵信號通路入手，進行了長期不懈的努力。Juan Carlos Zúñiga-Pflücker博士的研究團隊發現，在一種骨髓來源的OP9細胞系中表達NOTCH信號通路配體（DLL1/DLL4），在合適的時間添加FLT3L, IL-7等關鍵細胞因子，可以體外誘導造血幹祖細胞或多能幹細胞分化獲得部分CD8陽性為主的T細胞，功能試驗也證明這些細胞具備一定的免疫功能【1-3】。然而，生理狀態下天然T細胞的發育非常複雜，需要在胸腺中與自體多種細胞相互作用經歷陽性和陰性選擇過程，才能發育成熟為對自體免疫兼容的T細胞庫。顯然，當前的體外模擬技術尚未成熟，表現為體外產生的T細胞移植到體內產生與宿主免疫不兼容現象，甚至出現嚴重免疫排斥。

把體外誘導階段縮短到只產生T細胞種子(T cell precursors)，然後移植到體內在胸腺完成T細胞發育的二步法，成為再生功能完備的T細胞的重要研究思路【4, 5】。然而，以多能幹細胞(PSC/iPSC)作為起始細胞體外分化獲得的T細胞種子，表現出胸腺定植能力缺陷，無法歸巢到胸腺就無法發育輸出成熟的T細胞【6】。成體造血幹細胞能夠分化產生包括T細胞在內的各種獲得性免疫細胞，因此，誘導多能幹細胞或其他細胞類型產生功能上類似天然造血幹祖細胞的細胞種子，移植後體內發育為包括T細胞在內的多種譜系細胞的二步法，理論上也可以體內終生輸出功能性T細胞

早在iPSC誘導技術問世之前，來自Thomas Graf研究團隊的中國科學家謝華鋒博士在攻讀博士後期間就發現成體血液譜系類型之間可以被操縱實現完美命運轉換（B細胞轉分化為巨噬細胞）【13】。本研究所屬的課題組近期也發現Hoxb5能夠在體內將天然的B細胞轉分化為功能T細胞，為移植後迅速恢復骨髓移植病人早期的免疫力提供了潛在的新思路（Nat Immuno丨王金勇組建立T細胞體內再生新技術—程濤、劉勇軍點評）【14】。

除了上述進展，迄今尚沒有一種通用、高效的方法來誘導多能幹細胞實現體內T免疫系統特異重建。

越來越多的發育學證據表明，在HSC出現之前，就已經出現具有T細胞譜系潛能的造血祖細胞【15-18】。HSC依賴性的T細胞發育關鍵轉錄因子報道很多，然而對於在胚胎期非HSC依賴性造血祖細胞發育的內在驅動因素知之甚少。確認非HSC依賴性造血祖細胞的T淋系發育的內在驅動因素（如果存在的話），或許能夠幫助我們建立一個可靠的實驗方案以實現PSC高效重建T淋系發育。

2019年11月15日，來自中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院的王金勇課題組和中國人民解放軍總醫院第五醫學中心的劉兵課題組等國內科研團隊在Cell Research上發表了題為Guiding T lymphopoiesis from pluripotent stem cells by defined transcription factors的研究論文，首次報道了轉錄因子Runx1和Hoxa9協同表達可以高效誘導多能幹細胞（PSC）定向分化產生T細胞的種子細胞，將其移植後能夠在免疫缺陷鼠體內重建T免疫系統，再生途徑恢復了免疫缺陷鼠的T細胞免疫監視功能。採用這種二步法再生T細胞技術方案，該研究進一步基因編輯iPSC，使之帶上腫瘤相關抗原特異性TCR（TAA-TCR），成功實現體內再生腫瘤特異性TCR-T細胞，在實體瘤小鼠模型中有效遏制腫瘤生長。這種體內再生的抗腫瘤TCR-T細胞，具備Naïve表型，腫瘤抗原激活後可以產生效應T細胞和記憶T細胞。

在該研究中，作者首先構建了可誘導表達Runx1的ESC細胞系（iRunx1-ESC），並進行了T淋系分化潛能評估，結果移植實驗表明體內未產生ESC來源的T細胞。作者對iRunx1-ESC分化獲得的單個表型生血內皮細胞 (iHEC) 進行了單細胞測序，並與小鼠胚胎E11 的T1-pre-HSC（CD31+CD41lowCD45-c-Kit+CD201high）單細胞轉錄組數據進行了比較【19】。結果發現與造血發育相關的幾個關鍵轉錄因子Hoxa5、Hoxa7、Hoxa9、Hoxa10、Hlf、Ikzf1、Nkx2-3和Setbp1在iRunx1-ESC來源的iHEC細胞中表達量極低。

作者進一步採用“iRunx1+Xi”（Xi：Hoxa5、Hoxa7、Hoxa9、Hoxa10、Hlf、Ikzf1、Nkx2-3和Setbp1）串聯因子敲入策略繼續進行二步法篩選。通過篩選，發現在誘導進程的第6-11天開啟外源性Runx1和Hoxa9的表達，可以獲得豐富的iHEC細胞類型，而且這些iHEC與胚胎pre-HSC (CD31+CD41lowCD45-c-Kit+CD201high)表型類似。借鑑劉兵教授課題組開發的體外教育HEC向HSC成熟的技術【18】，將iHEC與OP9-DL1（GFP+）基質細胞系共培養10天后，可以檢測到大量的iHPC，其中包含有pre-thymic細胞表型（Lin-c-kit+CD127+/CD135+）的祖細胞。為了進一步評估iHPC的體內重建造血譜系潛能，作者將這些iHPC移植到經過亞致死劑量輻照處理的B-NDG小鼠（由中國北京百奧賽圖公司研發的一種NSG小鼠品系）中。移植4周後，在受體小鼠外周血成功檢測到供體來源的CD45.2+CD3+ T細胞，但未檢測到CD45.2+CD19+ B細胞和CD45.2+CD11b+髓系細胞。5組獨立實驗表明iR9-ESC來源的iHPC能夠在超過80%的B-NDG受體小鼠中產生CD3+ iT細胞（iT-B-NDG小鼠，32/40）。

作者進一步分析了iT-B-NDG小鼠中iT細胞的組織分佈和免疫表型。在iT-B-NDG小鼠的脾臟、淋巴結和外周血中均檢測到成熟TCRβ+CD4SP和TCRβ+CD8SP iT細胞，並在腸道和肺組織中檢測到iR9-ES來源的γδ iT細胞。在iT-B-NDG小鼠的脾臟和骨髓中也檢測到誘導型NK細胞（iNK，CD45.2+NK1.1+CD3-）。作者進一步發現在iT-B-NDG小鼠的胸腺中存在著誘導產生的CD4SP細胞、CD8SP細胞、DP細胞和DN淋巴細胞。其中，在移植4周後iDN細胞主要停留在iDN1階段，在移植5周後iDN細胞主要停留在iDN2和iDN3階段。作者進一步在骨髓裡檢測到iR9-ES來源的Lin-Sca1+c-Kit+ (iLSK)祖細胞。為了評估再生的iLSK細胞是否能夠重構小鼠的T淋巴譜系，作者從iT-B-NDG小鼠（移植後6周）中分選iLSK細胞，並進行二次移植實驗。二次移植6周後，可以在受體小鼠的外周血、骨髓和脾臟中檢測到成熟的iT細胞。作者進一步通過TCR深度測序確認了iT細胞具有豐富的TCRαβ多樣性。上述結果表明iR9-ESC來源iHPC在體內採用與天然T細胞發育相似的模式重建再生型T淋系發育。

為了進一步驗證iR9-ESC分化再生T細胞的效率，作者分選了iR9-ESC來源的單個iHEC細胞，分別在體外和體內進行了iT細胞誘導分化實驗。結果表明，單個iHEC細胞不但能夠在體外高效再生iT細胞，產生的單個造血集落還可以在體內重建T淋系發育。作者接著通過單細胞RNAseq對iHEC以及與OP9-DL1共培養不同天數產生的iHPC進行組學解析，發現iHEC表現出與胚胎EC和pre-HSC相似的分子特徵。更重要的是，iHEC來源的iHPC表現出與胸腺定植相關的基因表達特徵，例如表達Kit、Flt3、Cd7和Ccr9。

此外，為了評估iR9-ESC再生的iT細胞的功能，作者進行了異體皮膚免疫排斥實驗，發現iT細胞展現出典型的免疫監視功能，介導異體皮膚免疫排斥反應並保留免疫記憶。基於iPSC存在著細胞來源不受限制和易於進行基因編輯的優勢，作者將腫瘤抗原特異性TCR（MHC-I限制性OVA TCR，OT1）引入到iR9-iPSC中，評估iPSC來源的OT1-iT細胞的抗腫瘤活性。令人振奮的是，TCR修飾的iPSC產生的iT細胞能夠在實體瘤模型中展現出抗腫瘤活性。這些結果證明再生的iT細胞具有生理和抗腫瘤免疫功能。

總之，該研究建立了一種通過特定轉錄因子（Runx1和Hoxa9）組合誘導多能幹細胞定向分化為T細胞種子的方法。在單細胞水平確認了T譜系命運早在生血內皮細胞階段就已經決定，早於HSC的出現。分化再生的iHPC具有真正pre-thymic造血祖細胞的特徵，具備胸腺定植功能。該研究利用多能幹細胞為材料，重建T免疫系統，而且實現重建具有治療意義的T細胞抗腫瘤免疫，為T細胞相關免疫缺陷（如艾滋病）和T細胞抗腫瘤等轉化研究，提供了新的技術借鑑。據悉該技術業已申請國際PCT優先權，並獲得中國專利授權保護。

原文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41422-019-0251-7

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