四川大學華西藥學院Biomaterials：靶向自組裝肽抑制乳腺癌進展和轉移
DOI:10.1016/j.biomaterials.2020.120055
腫瘤細胞與周圍微環境之間無處不在的相互作用促進了腫瘤的轉移，因此中斷這些交流對抗轉移治療具有巨大的潛力。在此，研究者描述了一種原位自組裝策略，該策略限制了腫瘤細胞與腫瘤微環境（TME）之間的直接接觸。在這種策略中，Lys-Leu-Val-Phe-Phe（KLVFF）肽基序通過透明質酸（HA）功能化的脂質體靶向腫瘤，並自發地自組裝形成納米纖維，其網狀結構包裹在腫瘤細胞周圍。纖維納米結構掩蓋了膜的突起，因此阻礙了腫瘤細胞的遷移和侵襲，特別是通過有孔內皮的遷移。腫瘤細胞上的納米纖維塗層在體外顯著限制了腫瘤細胞誘導的血小板聚集，並在體內阻止血小板在循環腫瘤細胞（CTC）周圍的粘附，從而限制了血小板的促轉移作用並防止了早期轉移。此外，納米網穩定地保留在原發腫瘤部位72小時以上，並有效地阻止了腫瘤內血小板的激活，從而抑制了4T1乳腺癌小鼠模型中的腫瘤進展和自發性肺轉移。該研究通過調節腫瘤細胞與TME之間的相互作用，為抗腫瘤轉移鋪平了道路。
圖1.脂質體的表徵。 （A）通過DLS測定的脂質體的流體動力學尺寸分佈和PDI。 （B）通過DLS測定脂質體的表面ζ電位分佈。（C）通過TEM測定脂質體的形態。比例尺：100 nm。（D）當與KF-Lipos共孵育時Th T的熒光發射光譜。（E）脂質體中DPH的熒光各向異性（平均值±SD，n=3）。（F）以不同的FITC/Cy3摩爾比記錄的從490至650nm的FITC-HA/Cy3-Lipos的熒光發射光譜。（G）用HAase處理的FITC-HA/Cy3-Lipos的熒光發射光譜。（H）在37℃下通過FRET分析研究的FITC-HA/Cy3-Lipos的血清穩定性（平均值±SD，n=5）。（I）通過濁度測量研究空白脂質體的穩定性（平均值±SD，n=5）。（J）在37℃下以不同FITC/Cy3摩爾比的FITC-HA/Cy3-Lipos處理的4T1細胞的代表性CLSM圖像。（K）在靜脈內施用FITC-HA/Cy3-Lipos後4小時從小鼠中獲得的腫瘤組織的冷凍切片的代表性CLSM圖像。
圖2.癌細胞形態和細胞膜定位。（A）用Lipos、HA-Lipos和KF-Lipos處理4小時並以未處理的4T1作為對照的4T1細胞的SEM圖像。紅色箭頭，纖維狀結構；白色箭頭，顆粒結構。（B）分別用DiD-Lipos、HA-DiD-Lipos和KF-DiD-Lipos孵育2 h的4T1細胞的CLSM圖像，並進行定量分析。（C）結合的示意圖說明了KF-Lipos在癌細胞膜上的結構轉化。
圖3.乳腺癌細胞在3D環境中利用了增加的內皮通透性和腫瘤侵襲抑制能力。 （A）3D Matrigel入侵檢測。比例尺，100μm（上）； 200μm（下）。（B）用於粘附測定的實驗方案。（C） 在對照緩衝液（I）、遊離Dox（II）、Dox-Lipos（III）、HA-Dox-Lipos（IV）和KF-Dox-Lipos（V）處理後，具有代表性的熒光圖像顯示MDA-MB-231細胞在基質表面的利用性附著，並半定量測定腫瘤細胞的利用性附著程度（VI）。數據為平均值±SD，n=4。（D）遷移測定的實驗方案。（E）代表性的熒光圖像顯示4T1細胞在暴露於對照培養基（I）、遊離Dox（II）、Dox-Lipos（III）、HA-Dox-Lipos（IV）和KF-Dox-Lipos（V）的利用性遷移和半定量測定癌細胞的利用性遷移程度（VI）。數據為平均值±SD，n=4。
圖4.KF-Dox-Lipos處理抑制了血小板的轉移促進作用。（A）在對照緩衝液和Dox存在下與Plts-PKH26孵育的4T1-CFSE的代表性共聚焦圖像。在培養基（II）、遊離Dox（IV）、Dox-Lipos（V）、HA-Dox-Lipos（VI）和KF-Dox-Lipos（VII）存在下，以單獨培養基（I）或添加到下腔室（III）中的血小板用作對照，與血小板孵育後的遷移（B）或侵入（C）4T1細胞的標準化數量（n=4）。（D）經內皮遷移試驗的實驗方案。（E）4T1細胞浸潤內皮細胞單層的典型CLSM圖像。（F）BALB/c小鼠肺中4T1-CFSE和Plts-PKH26的代表性共聚焦圖像。（G）代表性的小鼠主要器官的體外生物發光圖像。（H）在第15天採集的指定肺組織的H＆E染色。比例尺，3mm。
圖5.藥代動力學和生物分佈檢查。（A）Dox的體內藥代動力學特徵。數據代表平均值±標準偏差（n=5）。（B）在不同時間靜脈注射遊離DiD（I）、DiD-Lipos（II）、HA-DiD-Lipos（III）和KF-DiD-Lipos（IV）後的荷瘤小鼠體內熒光圖像。（C）注射後72小時切除的腫瘤和主要組織的離體熒光圖像。（D）腫瘤和主要組織的熒光強度的ROI分析。數據代表平均值±標準偏差（n=3）。（E）Dox治療腫瘤的代表性CLSM圖像。Dox，綠色；CD 31，紅色；DAPI，藍色。
圖6.體內抗腫瘤和抗轉移功效評價。（A）靜脈注射不同Dox製劑後的腫瘤生長曲線。n=7。（B）在不同治療組中攜帶4T1腫瘤的小鼠的Kaplan-Meier生存曲線。通過對數秩檢驗測定統計學顯著性。（C）在第29天（上圖）和第36天（下圖）採集的小鼠肺組織的代表性圖像。（D）通過H＆E染色對各組肺轉移灶的組織學檢查。比例尺，2毫米。（E）第36天，通過肉眼觀察各組肺中轉移結節的數目。與鹽水組相比，＃p＜0.05。（F）各種樣品對肺轉移的抑制率（n=6）。（G）在第29和36天的肺轉移的相對面積。p＜0.05，*與鹽水對照相比顯著。第29天，n=7；第36天，n=6。
圖7.組織化學檢查。（A）腫瘤切片的剛果紅（紅色）染色。（B）4T1腫瘤切片的TEM成像。紅色箭頭表示澱粉樣纖維原位組裝。（C）腫瘤組織中P-選擇素（活化血小板的標記）的免疫組織化學測定。比例尺，2μm。（D）在腫瘤組織中的E-鈣粘蛋白（上圖）和MMP-9（下圖）的免疫組織化學測定。比例尺，50μm。
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