撰文：東海先生
首發：間充質幹細胞
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2013年，諾貝爾生理學或醫學獎授予了三位科學家，表彰其在細胞間囊泡運輸調控機制領域作出突出貢獻。諾獎的肯定，使得細胞分泌的胞外囊泡及其生理學功能成為熱點，得到廣泛的研究。
1外泌體是一種胞外囊泡
不同類型的細胞均可以通過出芽方式釋放各種各樣的膜包裹的囊泡（如外泌體、微囊泡、凋亡小體）到它們的細胞外環境中，大小從大約40 nm到幾mm不等。這些分泌的囊泡統稱為胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EV），或稱為微囊泡（microvesicles）[1]。EV的外膜為磷脂膜，包含特定細胞類型的蛋白質組合，包括酶、生長因子、受體和細胞因子以及脂質、編碼和非編碼RNA和代謝物[1, 2]。直徑約為40-150nm的胞外囊泡，即為外泌體（exosome）。
早在20世紀60年代，EV的生理功能得到闡述，EV在細胞、器官之間，甚至在有機體之間傳遞信息，並在體液中檢測到，如血液、尿液、腦脊液、母乳和唾液[3]。由於其穩定的脂質雙層膜結構和在生物液中的運輸能力，EV可以在細胞之間運輸和轉移生物活性分子，如蛋白質和RNA，介導靶向細胞間信號傳遞，甚至是遺傳信息的功能性轉移，這一發現極大地促進了該領域的發展[2, 4, 5]。
2MSC分泌的EV及其功能應用
同樣，間充質幹細胞（MSC）也分泌大量的EV，EV內容物包括各種蛋白和RNA等。在MSC來源的EV中，大多數RNA（>80%）；另外還有一些小RNA，其中miRNA約為44%、tRNA約為47%[6]。幹細胞通過這些胞外囊泡（EV）與其他組織細胞相互交流信息，發揮幹細胞的治療作用。
MSC來源的EV也表達MSC表型標記，如CD29、CD73、CD44和CD105，可以通過傳統的流式細胞術進行鑑定[7]。蛋白質組學研究揭示人MSC-EV許多獨特的蛋白質，如表面受體（PDGFRB、EGFR和PLAUR）、信號分子（RRAS/NRAS、MAPK1、GNA13/GNG12、CDC42和VAV2）、細胞粘附分子（FN1、EZR、IQGAP1、CD47、整合素和LGALS1/LGALS3），以及MSC相關抗原（CD9、CD63、CD81、CD109、CD151、CD248和CD276）[8]。
MicroRNAs（miRNAs）是一種短的、非編碼的RNA，它調節mRNA靶標的表達，並在轉錄後沉默中發揮作用。miRNAs在幹細胞中的重要作用已經在廣泛的生物學過程中得到了研究，包括髮育、分化、細胞死亡、幹細胞增殖和分化、免疫反應、衰老和癌症。據估計，人類基因組編碼超過1000個miRNAs，針對大約60%的人類蛋白編碼基因[9]。通過質譜和陣列分析，已經在MSC-EVS中鑑定出850多個獨特的基因產物和160多個miRNAs[10, 11]。
（一）組織器官損傷
MSC-EV已經在幾種不同類型的疾病中顯示出令人鼓舞的治療效果，包括腎損傷、心臟損傷、腦損傷和肝肺損傷等[12, 13]。MSC的旁分泌/內分泌機制很可能是由MSC-EV介導的[14, 15]。MSC-EV恢復和維持組織微環境內穩的潛力取決於蛋白質和RNA轉移的生化能力。
MSC分泌的EV在急性和慢性腎損傷中均有保護的特性[16-18]。MSC-EV中的生長因子mRNA可以轉移到順鉑損傷的近端腎小管上皮細胞(PTEC)，可促進PTEC增殖；IGF-1R的mRNA通過體外水平轉移到腎小管上皮細胞，增強了腎小管細胞對局部產生的IGF-1的敏感性[19]。如果骨髓MSC-EV的microRNA耗竭，那麼MSC-EV在急性腎損傷中的固有再生修復能力出現顯著的降低，提示在急性腎損傷後的恢復過程中，miRNAs起著關鍵作用[20]。
在心肌梗死方面，體外擴增的MSC培養上清液已成功用於縮小小鼠心肌梗死範圍[15, 21-23]。MSC上清液的促再生活性被證明為EV組分，而去除EV後的可溶性組分並沒有作用效果[15]。MSC-EV介導的細胞保護作用可減輕大腸桿菌內毒素誘導的小鼠急性肺損傷和低氧誘導的肺動脈高壓[24, 25]。MSC-EV還展示了減輕藥物誘導肝損傷和肝纖維化的能力[26, 27]。
MSC-EV對血管生成有直接的積極促進作用[28, 29]。在大鼠模型中，MSC-EV顯著改善了後肢缺血的灌注，加速了皮膚燒傷後的再上皮化，並提高了同種異體皮膚移植物的存活率[30, 31]。MSC-EV給藥已被證明在中風模型缺血性閉塞後促進功能恢復和新生血管，顯著改善了卒中誘導後的功能結果，但是MSC組和MSC-EV組沒有明顯的療效差異[32, 33]。在綿羊模型中，全身應用MSC-EV後也觀察到大腦缺氧損傷的改善[34]。miRNA-133b似乎與MSC-EV介導的大鼠缺血性卒中後的功能恢復有關[35]，而miRNA-22似乎與MSC-EV介導的缺血性心臟病心肌細胞的抗凋亡作用有關[36]。因此，MSC-EV可用於中風的治療，作為幹細胞輸注的替代方法，可改善神經預後，增加血管生成和神經生成[37, 38]。
另外，研究表明，來自健康供者的骨髓MSC-EV含高水平的腫瘤抑制因子miRNA-15a，miRNA-15a能夠抑制多發性骨髓瘤細胞的生長和誘導多發性骨髓瘤細胞的凋亡，從而維持疾病的穩定狀態抑制多發性骨髓瘤細胞的生長；而來自多發性骨髓瘤患者的骨髓MSC-EV含低水平的腫瘤抑制因子miRNA-15a[39]。健康和多發性骨髓瘤患者的骨髓MSC-EV激活AKT通路促進了骨髓瘤細胞的存活和抗藥性[40]。也有研究證明健康供者骨髓MSC-EV通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑，降低了骨髓瘤細胞的活性、增殖和遷移[41]。
（二）免疫調節功能
MSC來源的外泌體和EV具有相似的免疫調節功能，MSC-EV對許多類型的免疫細胞具有免疫調節作用，包括樹突狀細胞（DC細胞）、T細胞、B細胞和巨噬細胞[6, 42-44]。然而，有意思的是，在炎性關節炎模型中，MSC來源的外泌體在體內抑制炎症比MSC更加有效[45]。
MSC-EV對DC細胞的免疫調節作用機制部分是由microRNAs（miR-21-5p、miR-142-3p、miR-223-3p和miR-126-3p）介導的[46]。MSC-EV還可以通過增強M2巨噬細胞極化和間接驅動調節性T細胞誘導發揮免疫抑制作用[47]。MSC-EV還被證明可以抑制健康供者和GvHD患者的NK細胞和其他外周白細胞的激活[48]。MSC-EVS在體外與PBMC共培養時抑制T細胞的激活，促進 Treg 細胞的增殖[48, 49]。
根據陣列分析，與GVHD改善相關的多種可溶性因子在MSC-EV中呈現高度表達[50]。靜脈輸注MSC-EV可抑制CD4+T和CD8+T細胞的活化和浸潤，從而延長急性移植物抗宿主病（GVHD）小鼠的存活時間，並減少多個器官的病理損傷[51-53]。
3MSC-EV在體內分佈和安全性
在小鼠體內的生物發光和熒光介導的斷層成像顯示，靜脈注射EV的主要部位是脾、肝、肺和腎，也可以在注射後30分鐘內在腦、心臟和肌肉中檢測到EV，在60分鐘後尿液中檢測到EV[54]。
雖然已經觀察到，在動物腫瘤模型和體外細胞實驗層面，MSC-EV的促腫瘤和抗腫瘤作用的報道[55, 56]，但到目前為止還沒有其他副作用的報道。動物模型中沒有檢測到MSC-EV給藥的任何副作用，即使用PEG方法制備的MSC-EV在動物身上的劑量比相應的急性GvHD患者高100倍。因此，可以認為MSC-EV給藥基本上是安全的[57]。由於EV不能自我複製，因此缺乏任何內源性腫瘤形成潛力[58]。
4MSC-EV的臨床應用
2011年進行了第一次有記錄的臨床MSC-EV給藥；MSC-EV以遞增的劑量應用於1例類固醇耐藥的GVHD患者，從4×107個MSC培養上清液中分離的MSC-EVS數量為1.3-3.5×1010個顆粒或0.5-1.6mg；這個劑量的MSC-EV被定義為1個單位，MSC-EV每隔2~3天靜脈注射一次，共2周，患者總共接受了4個單位，GvHD症狀顯著下降，每日類固醇劑量可從125 mg減少到30 mg，患者在MSC-EV治療後穩定了5個月，而且MSC-EV給藥耐受性良好，未觀察到副作用[48]。
對20例慢性腎臟病（CKD）患者進行的Ⅱ/Ⅲ期臨床研究表明，臍帶MSC-EV（2次，相隔1周）可改善腎小球濾過率、血肌酐水平、血尿素和尿白蛋白肌酐比值，伴隨著TGF-β1、IL-10水平明顯升高和血漿TNF-α水平顯著下降（在治療後12周的TGF-β和IL-10水平高於一年後；相反，腫瘤壞死因子-α水平在一年後略低於12周後），沒有一名患者顯示出任何副作用[59]。
MSC-EV應用於8例患者用於牙槽骨再生，沒有出現不良反應；放射學評估顯示所有病例均有早期骨形成；注射部位的炎性淋巴細胞浸潤很少[60]。這個臨床研究證明了MSC-EV在骨再生醫學中具有較大的成骨潛力。
對7例長期存在的大型特發性難治性黃斑裂孔（MH）患者，年齡51~75歲，行玻璃體切除、內界膜剝離、MSC（2例）或MSC-EV（外泌體）（5例）玻璃體腔內注射；5例MH閉合術患者最佳矯正視力提高，其中1例接受MSC治療的患者在視網膜表面觀察到纖維膜，1例接受較大劑量MSC-EV的患者出現炎症反應[61]。
5MSC-EV的產業化
MSC-EV具有免疫調節活性並促進再生過程，其方式顯然與MSC相當。因此，基於EV的無細胞療法，為多種疾病提供了一種基於幹細胞治療的有前途的替代方案[12]。與細胞療法相比，EV療法具有一些優勢，但由於該領域的新穎性，其臨床分級生產、質量保證和應用缺乏國際公認的指南。
改變MSC的培養環境，用不同的外界刺激預處理，這不僅可以增加EV的產量，還可以調節它們的成分，從而增強有益的治療效果[62]。例如，無論是用中風患者血清培養MSC，還是用缺血腦組織提取液處理，都可以激活MSC釋放更多的EV [63, 64]。MSC培養時給予炎症刺激，將增強抗炎特性的EV釋放[65]。應當評估EV製備的純度和一致性，在EV收穫過程中使用的所有生物材料都符合要求的法規遵從性。
與傳統的2D平面培養的MSC相比，與微載體結合的3D球形培養的MSC顯示出更高的EV分泌量，並降低了整合素的表達，原因可能在於3D培養的MSC細胞密度高於2D培養[66-68]。採用3D的培養方法方法在MSC-EV的生產中可能有優勢，因為(1)需要大量的培養基才能獲得大量臨床使用的EV；(2)通過持續的培養基灌流，避免代謝副產物在生物反應器中積累，可以維持MSC的活性，而無需使用含有大量異種EV的血清；以及(3)通過控制進出生物反應器的培養基流量來連續產出[37]。
超速離心是收集EV最常用、最常規的方法。商業上可以買到的試劑盒，是一種快速而簡單的試劑盒，但它是一種相對粗糙的分離方法，受到許多可溶性蛋白汙染。超速離心的方法足以獲得純EV用於實驗室實驗，但在臨床環境下，這種方法耗時長，不適合大規模生產EV。
超速離心促進囊泡聚集，常常共分離到可溶性因子和蛋白質[69]。基於密度梯度的分離允許基於浮力密度分離囊泡，為EV淨化提供了最高效率[70, 71]。最近，一些新興的技術，如尺寸排除色譜、聲學分離、納米捕捉器、流場流動分級，都有可能從不同的樣品基質中分離出EV，每種方法都利用了EVS的特定生物物理特性，如它們的大小、密度、形狀或表面受體[72]。
以EV為基礎的治療藥物生產的另一個方面是質量保證。雖然來自幾個動物模型和已報道的人體研究的數據表明，MSC-EV發揮了治療作用，沒有引起副作用，但必須建立適當的質量控制標準，以確保所產生的EV產品的質量、安全性和有效性。EV儲存在等滲緩衝液中，以防止儲存和凍融循環期間的pH變化。比如人中性粒細胞來源的抗菌胞外囊泡（EV）在-80°C下保存對EV數量和大小沒有顯著影響（最好不超過7天），而廣泛使用的冷凍保護劑能誘導EV裂解[73]。
因此，為了開發基於EV的藥物，至少需要克服一些限制：(1)為EV的大規模製備、純化和儲存建立推薦的分離方案；(2)EV的量化、分子和物理EV表徵的標準化方案；以及(3)明確的臨床使用質量控制(QC)標準[58]。
幹細胞外泌體（這裡特指MSC-EV）是一個研究和應用都值得期待的好方向，但是需要腳踏實地地去做些工作。
參考文獻
略
乘幹細胞之東風——火爆“外泌體”的崛起
彙總：值得關注的幹細胞領域研究進展
乾貨：國內外間充質幹細胞應用進展（PPT）
乾貨：皮膚幹細胞與器官形成再生（PPT）
乾貨：幹細胞講的最清楚的一份PPT，值得收藏
傳說中的“幹細胞”提取物到底是怎麼一回事
乾貨：流式檢測外泌體，大小並不簡單（PPT）
如何看待外泌體在皮膚損傷修復中的作用
臍帶間充質幹細胞外泌體，再生醫學的新“武器”
— END —
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