清光緒帝的死因，100多年來一直是史學界爭論的焦點。
在用醫學檢測的手法歷時多年研究之後，2008年11月國家清史編纂委員會在北京舉行清光緒帝死因研究工作報告會，正式宣佈其死於急性砒霜中毒。光緒被人用砒霜毒死，一段糾纏了100年的光緒死因之謎，就此破解。
檢測報告分析：
光緒頭髮中含有高濃度的砷元素，且各階段含量差異很大，第1縷頭髮的砷高峰值出現在第10段(2404μg/g)，第2縷頭髮的砷高峰值出現在第26段(362.7μg/g)和第45段(202.1μg/g)。一方面，光緒帝頭髮中的最高砷含量高達2 404μg/g，均是其棺槨內物品和墓內外環境樣品最高砷含量的數十倍，表明其頭髮中的最高砷含量非外界因素所造成。另一方面，砷含量分佈曲線與慢性中毒者截然不同，表明其頭髮最高砷含量亦非慢性砷中毒形成。從光緒帝頭髮的異常高砷含量截段位置判斷（既不在髮根處、也不在髮梢處），並依據頭髮生長規律和砷中毒機理，光緒帝頭髮上的高含量砷不應是正常攝入代謝形成。
綜上所述，造成光緒帝頭髮上高含量砷元素異常現象的成因，只能是自身屍體的沾染。又通過對光緒帝遺骨表面砷元素的檢測、對其殯葬衣物被侵蝕的規律以及衣物上砷元素含量的分佈情況分析和砷種態分析及科學測算知，光緒帝攝入體內的砒霜總量明顯大於致死量。結論是被毒死。
據記載，光緒在中毒當晚急召太醫，但是太醫當晚被阻攔在宮門外，未能進入為光緒帝診治。次日早晨發現光緒帝腹痛難忍在床上打滾，經太醫檢查，“面黑，舌黃黑”，便緊急為光緒診治，但是所開方藥無一味對症。並於幾天後去世。
明確光緒帝是中毒身亡後，那麼他又是被誰下毒殺害的呢？據相關文獻記載，有三種說法：袁世凱毒死說、李蓮英毒死說、慈禧毒死說死說。對於前兩種觀點據漏洞較大已經排除。但是慈禧毒死說法較多，且存在相關的證據分析！
1、《啟功口述歷史》上有記載：啟功曾祖父在太后住所外侍疾，“就在宣佈慈溪死前，我曾祖父看見一個太監端著一個碗蓋從樂壽堂出來，出於職責，就問這個太監端的是什麼？太監答道：“是老佛爺賞給萬歲爺的塌喇（即酸奶）”。當時光緒被軟禁在中南海的，隆裕皇后一直在慈禧身邊。但自慈禧送完塌喇不久後劉宣佈光緒駕崩了。按正常邏輯推演，這是“慈禧毒死說”的力證。
2、據光緒日講起居注官惲毓鼎在《崇陵傳信錄》裡記載：“時太后病洩瀉數日矣。有譖上者，謂帝聞太后病。有喜色。太后怒曰：‘我不能先爾死！’”由此也可判斷，慈禧似乎就命人將光緒帝先行謀害。作為起居注官的記錄，真實性還是很高的，進一步論證了“慈禧毒死說”這個觀點。
3、光緒的醫生杜鍾駿在《德宗請脈記》上有記載：“十月十九日有年約三十許太監， 穿藍寧綢半臂侍側， 傳述病情”。由此可知，是太監傳述病情。又記載，十月十九日光緒帝就已經不能說話了，但在十月十八日還能與醫生交談。在此就產生矛盾了。《鹿傳霖日記》中：“張仲元密告慈脈， 氣極弱， 恐脫。”這一天，慈禧病情大變，十八日比起前幾日食物大減，十九日二十日可能是病重，什麼都沒吃。她似乎已經知道自己可能將不久於人世。光緒帝這一天突然和十七日一樣再次直線下滑，聯繫到《啟功口述歷史》，事情發生時間點非常巧合。這也論證了襯慈禧毒死的說法。
慈禧為什麼要毒死光緒呢，其主要原因，光緒在戊戌變法中重用的官員都屬激進的改革派，這些人想法過於激進，而改革不可操之過急，有些做法不切實際。這樣會造成旗人的權利和利益直接受損，進一步削弱慈禧手中的權力。而另一層面，康有為是拿著自己的想法在做一種改革實驗。
從歷史發展到的今天來看光緒帝並沒有這種意識。在那樣的歷史背景，像康有為如此激進之人比比皆是。若按光緒所為，極有可能激起手掌軍權的滿漢官員聯合推翻光緒，另立新主。加之國外勢力的摻和，大清朝恐怕難保。勢必會造成時局動盪，天下反。加之罷黜鹿傳霖等人，如若鬧起農民起義，則朝廷基本上都沒人能夠鎮壓。另一方面，慈禧臨終前讓隆裕皇后以及醇親王載灃掌權，其有很大意向是想讓自己的孃家葉赫那拉氏掌權。如果光緒上臺，她的心機則就會被打破。更糟糕的是，大清的三百多年基業可能也會因此而消亡。
所以，為了時局穩定，為了葉赫那拉家族，為了大清基業，為了實現時局的一時穩定，只有光緒不掌權才能實現。這樣看來，則只有一種可能，光緒不在人世或者光緒不掌權，那麼光緒的死亡是最直接解決問題的。站在慈禧的角度來看，光緒帝的死看來變得是那麼的自然。
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