清光绪帝的死因，100多年来一直是史学界争论的焦点。
在用医学检测的手法历时多年研究之后，2008年11月国家清史编纂委员会在北京举行清光绪帝死因研究工作报告会，正式宣布其死于急性砒霜中毒。光绪被人用砒霜毒死，一段纠缠了100年的光绪死因之谜，就此破解。
检测报告分析：
光绪头发中含有高浓度的砷元素，且各阶段含量差异很大，第1缕头发的砷高峰值出现在第10段(2404μg/g)，第2缕头发的砷高峰值出现在第26段(362.7μg/g)和第45段(202.1μg/g)。一方面，光绪帝头发中的最高砷含量高达2 404μg/g，均是其棺椁内物品和墓内外环境样品最高砷含量的数十倍，表明其头发中的最高砷含量非外界因素所造成。另一方面，砷含量分布曲线与慢性中毒者截然不同，表明其头发最高砷含量亦非慢性砷中毒形成。从光绪帝头发的异常高砷含量截段位置判断（既不在发根处、也不在发梢处），并依据头发生长规律和砷中毒机理，光绪帝头发上的高含量砷不应是正常摄入代谢形成。
综上所述，造成光绪帝头发上高含量砷元素异常现象的成因，只能是自身尸体的沾染。又通过对光绪帝遗骨表面砷元素的检测、对其殡葬衣物被侵蚀的规律以及衣物上砷元素含量的分布情况分析和砷种态分析及科学测算知，光绪帝摄入体内的砒霜总量明显大于致死量。结论是被毒死。
据记载，光绪在中毒当晚急召太医，但是太医当晚被阻拦在宫门外，未能进入为光绪帝诊治。次日早晨发现光绪帝腹痛难忍在床上打滚，经太医检查，“面黑，舌黄黑”，便紧急为光绪诊治，但是所开方药无一味对症。并于几天后去世。
明确光绪帝是中毒身亡后，那么他又是被谁下毒杀害的呢？据相关文献记载，有三种说法：袁世凯毒死说、李莲英毒死说、慈禧毒死说死说。对于前两种观点据漏洞较大已经排除。但是慈禧毒死说法较多，且存在相关的证据分析！
1、《启功口述历史》上有记载：启功曾祖父在太后住所外侍疾，“就在宣布慈溪死前，我曾祖父看见一个太监端着一个碗盖从乐寿堂出来，出于职责，就问这个太监端的是什么？太监答道：“是老佛爷赏给万岁爷的塌喇（即酸奶）”。当时光绪被软禁在中南海的，隆裕皇后一直在慈禧身边。但自慈禧送完塌喇不久后刘宣布光绪驾崩了。按正常逻辑推演，这是“慈禧毒死说”的力证。
2、据光绪日讲起居注官恽毓鼎在《崇陵传信录》里记载：“时太后病泄泻数日矣。有谮上者，谓帝闻太后病。有喜色。太后怒曰：‘我不能先尔死！’”由此也可判断，慈禧似乎就命人将光绪帝先行谋害。作为起居注官的记录，真实性还是很高的，进一步论证了“慈禧毒死说”这个观点。
3、光绪的医生杜钟骏在《德宗请脉记》上有记载：“十月十九日有年约三十许太监， 穿蓝宁绸半臂侍侧， 传述病情”。由此可知，是太监传述病情。又记载，十月十九日光绪帝就已经不能说话了，但在十月十八日还能与医生交谈。在此就产生矛盾了。《鹿传霖日记》中：“张仲元密告慈脉， 气极弱， 恐脱。”这一天，慈禧病情大变，十八日比起前几日食物大减，十九日二十日可能是病重，什么都没吃。她似乎已经知道自己可能将不久于人世。光绪帝这一天突然和十七日一样再次直线下滑，联系到《启功口述历史》，事情发生时间点非常巧合。这也论证了衬慈禧毒死的说法。
慈禧为什么要毒死光绪呢，其主要原因，光绪在戊戌变法中重用的官员都属激进的改革派，这些人想法过于激进，而改革不可操之过急，有些做法不切实际。这样会造成旗人的权利和利益直接受损，进一步削弱慈禧手中的权力。而另一层面，康有为是拿着自己的想法在做一种改革实验。
从历史发展到的今天来看光绪帝并没有这种意识。在那样的历史背景，像康有为如此激进之人比比皆是。若按光绪所为，极有可能激起手掌军权的满汉官员联合推翻光绪，另立新主。加之国外势力的掺和，大清朝恐怕难保。势必会造成时局动荡，天下反。加之罢黜鹿传霖等人，如若闹起农民起义，则朝廷基本上都没人能够镇压。另一方面，慈禧临终前让隆裕皇后以及醇亲王载沣掌权，其有很大意向是想让自己的娘家叶赫那拉氏掌权。如果光绪上台，她的心机则就会被打破。更糟糕的是，大清的三百多年基业可能也会因此而消亡。
所以，为了时局稳定，为了叶赫那拉家族，为了大清基业，为了实现时局的一时稳定，只有光绪不掌权才能实现。这样看来，则只有一种可能，光绪不在人世或者光绪不掌权，那么光绪的死亡是最直接解决问题的。站在慈禧的角度来看，光绪帝的死看来变得是那么的自然。
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