宏基因组学(又称元基因组学，Metagenomics)，是环境样品中所有微生物基因组集合的研究技术和方法
[1]。根据分析对象和实验目的，环境微生物的宏基因组研究基本上可以分为三类：核糖体rDNA的分类和鉴定（如原核16S rDNA、真菌18S / 28S rDNA、ITS等）、功能基因的多样性和分类分析(如固氮还原酶nifH基因、氨单加氧酶amoA基因等)，以及全部宏基因组DNA的整体测序和分析等。从实验手段来看，目前宏基因组研究主要以高通量检测技术为主，部分研究也采用基因芯片技术[2]。随着高通量测序价格的持续走低，基于宏基因组测序的微生物生态学研究逐渐增多。宏基因组测序技术可以绕开“大部分环境微生物不可培养”的壁垒，不仅可以
获得微生物群落的多样性和功能组成，还可以此结果为依据，发掘环境中新的功能酶或基因，可谓是将微生物分类-功能组成-应用开发结合了起来，因此其在目前环境微生物学研究中占据主导地位。Springer出版社自2010年发表第一版以“Metagenomics”为题的宏基因组学研究方法指导书以来，又在此基础上总结了宏基因组学研究的最新进展和方法，于2017年发表了第二版“Metagenomics”指导书。全书共包括19个章节，详述了环境样本的DNA / RNA提取、宏基因组文库构建、活性微生物宏基因组研究、植物内生菌研究、基于宏基因组的数据挖掘及后期功能酶或基因的表达、筛选等具体实例、步骤和方法，是难得的宏基因组学研究宝典。
卢瑟菌将该书19个章节的目录翻译成中文并作了简要介绍，让我们一起来了解下这本书的主要内容吧（按章节排序）：
1 小片段和大片段宏基因组文库构建（Construction of Small-Insert and Large-Insert Metagenomic Libraries）
本章详述了基于plasmids和fosmids质粒的短片段与长片段宏基因组文库构建方法。
2 海水样品总DNA、RNA提取及用以Marker基因研究的通用模板cDNA合成（Extractionof Total DNA and RNA from Marine Filter Samples and Generation of a cDNA asUniversal Template for Marker Gene Studies）
本章详细描述了一种从海水样本中同时提取DNA和RNA的方法，并详述了如何将RNA用通用引物合成cDNA以进行后续marker基因的研究。
3 海洋宏基因组大插入片段文库的构建及筛选（Constructionand Screening of Marine Metagenomic Large Insert Libraries）
本章介绍了从海水样本采集、DNA提取、宏基因组文库构建到基于序列和功能的宏基因组筛选的详细步骤。
4 低温和碱性极端环境下宏基因组文库的构建及筛选（Constructingand Screening a Metagenomic Library of a Cold and Alkaline Extreme Environment）
本章以格陵兰岛南部常年低温（<6℃）、高pH（>10）极端海洋环境中的方解石柱为样本，详述了样本DNA提取、宏基因组文库构建及耐低温、高pH活性酶的筛选步骤。
5 DNA、RNA、蛋白质稳定同位素探针（SIP）结合宏组学分析微生物群落活性（DNA-,RNA-, and Protein-Based Stable-Isotope Probing for High-Throughput Biomarker Analysis of Active Microorganisms）
本章详述了用稳定同位素探针（SIP）结合宏组学方法（宏基因组/转录组/蛋白组）方法，从DNA、RNA、蛋白质三个层面研究环境微生物的代谢活性。
稳定同位素探针（SIP）结合宏组学研究微生物活性策略流程
6 植物内生细菌、真菌多样性评估（Assessing Bacterial and Fungal Diversity in the Plant Endosphere）
研究植物内生菌的一个难点是如何排除来自宿主基因组的污染问题，本章详细介绍了通过高度特异性引物扩增的方法排除宿主基因污染的内生菌多样性研究策略，从植物样本处理、核酸提取、PCR扩增到高通量测序及后期数据分析都进行了详尽地描述。
7 复杂微生物群落中植物软腐肠杆菌科宏基因组测序分析（Shotgun Metagenomic Sequencing Analysis of Soft-RotEnterobacteriaceae in Polymicrobial Communities）
本章主要讲述了如何通过宏基因组测序手段分析诱发植物软腐病的肠杆菌科病原菌，其中也提到了一种细菌DNA富集方法，可有效降低来自真核宿主的基因污染。
宏基因组测序后数据分析流程
8 变铅青链霉菌中宏基因组DNA的克隆、表达及后续发酵条件优化（Cloning and Expression of Metagenomic DNA inStreptomyces lividansand Subsequent Fermentation for Optimized Production）
变铅青链霉菌是常用的革兰氏阳性表达宿主之一，本章详述了如何以其为宿主对环境宏基因组中的DNA进行克隆、表达，并介绍了基于宿主的发酵条件优化方法。
9 基于宏基因组数据指导的降解网络重构（Degradation Network Reconstruction Guided by Metagenomic Data）
本章详细介绍了如何从环境宏基因组数据中挖掘有机物降解相关的基因，并根据数据库对有机底物的代谢过程作出预测，构建基于环境样品宏基因组数据的降解代谢网络。
基于两组不同样品宏基因组数据构建的芳香烃代谢网络图
10 基于宏基因组的功能基因表达新工具（Novel Tools for the Functional Expression of Metagenomic DNA）
基于宏基因组文库的功能基因表达受限于多种因素（如靶基因转录或翻译效率低、因缺乏合适分子伴侣或辅因子而使得蛋白错误折叠或组装等），一个有效提高基因表达成功率的方法是采用不同的宿主菌。本章详述了如何在五种不同宿主菌（Escherichiacoli,Pseudomonas putida,Bacillus subtilis,Burkholderia glumae,Rhodobacter capsulatus）中表达宏基因组测序获得功能基因的方法。广宿主穿梭载体在不同宿主菌中的使用，使基于活性的宏基因组DNA筛选成为现实。另外，本章还介绍了一种最新的转移-表达系统（TREX），可实现大的功能基因簇在不同物种中的表达。
11 基于微量滴定板方法高通量地筛选文库中活性、立体选择性的水解酶 （A Microtiter Plate-Based Assay to Screen for Active and Stereoselective HydrolyticEnzymes in Enzyme Libraries）
本章详述了如何用微量滴定板法高通量地筛选宏基因组文库中有活性和不同立体选择性的酯酶等水解酶的详细方法。
基于微量滴定板方法的宏基因组文库活性水解酶筛选流程
12 基于宏基因组文库的纤维素酶筛选（Screening for Cellulase Encoding Clones in Metagenomic Libraries）
纤维素酶在生物乙醇生产、纺织业等领域有重要的应用，本章详述了如何基于宏基因组文库筛选适应不同条件的高效纤维素酶。
13 基于宏基因组文库的木质纤维素酶液相多通路高通量筛选（Liquid Phase Multiplex High-Throughput Screening of Metagenomic Libraries Using p-Nitrophenyl-Linked Substrates for Accessory Lignocellulosic Enzymes）
本章详述了基于宏基因组文库并结合液相多通路方法，可实现三种木质纤维素酶（β-glucosidases, β-xylosidases, α-L-arabinofuranosidases）同时高通量筛选。
基于宏基因组文库的木质纤维素酶液相高通量筛选方法流程
14 基于宏基因组文库的多酚类修饰糖基转移酶筛选 （Screening Glycosyltransferases for Polyphenol Modifications）
糖基转移酶在很多药物的糖基化修饰中有重要作用，本章详述了一种基于宏基因组筛选克隆是否发生糖基化修饰的新方法，该方法也可用于研究其他类型的修饰，如甲基化等。
15 复杂微生物群落中分离编码新型PHA代谢酶基因的方法（Methods for the Isolation of Genes Encoding Novel PHA Metabolism Enzymes from Complex Microbial Communities）
PHA（聚羟基脂肪酸）是一类微生物聚酯，在生物塑料生产等领域有广泛的前景。本章详细介绍了如何根据宏基因组文库从复杂的微生物群落中分离PHA代谢途径中相关酶基因的方法。
16 基于功能宏基因组文库的磷酸酶活性编码基因的筛选和异源表达（Function-Based Metagenomic Library Screening and Heterologous Expression Strategy for Genes Encoding Phosphatase Activity）
磷酸酶在食品加工、生物修复、医学诊断等领域有广泛应用，本章详细介绍了基于宏基因组文库筛选并异源表达活性磷酸酶编码基因的方法。
17 基于宏基因组文库的活性氢化酶筛选（Activity-Based Screening of Metagenomic Libraries for Hydrogenase Enzymes）
氢化酶不仅在生物代谢中有重要作用，也可催化质子产生氢气，在清洁能源开发中有巨大潜力。本章详述了如何通过宏基因组手段筛选高活性氢化酶的过程。
基于宏基因组文库的[NiFe]-氢化酶筛选流程
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基于宏基因组的N-AHSL信号干扰酶的筛选（Screeningfor N-AHSL-Based-Signaling Interfering Enzymes）群感效应（Quorumsensing，QS）是指细菌根据密度变化，通过释放小分子信号物质，对自身或其他菌群的基因表达进行调控的现象。其大致过程为：细菌向胞外分泌自诱导信号分子（autoinducer，AI）；AI分子在体外积累到一定阈值，就与细菌表面、膜上或胞内的特定受体结合，从而改变胞内基因表达，参与多种生理、病理过程，如细菌的群集运动、抗生素抗性、细菌致病性等。N-AHSL就是群感效应中一种重要的信号分子，与某些病原菌的致病性密切相关。本章介绍了如何通过环境样品的宏基因组文库方法筛选N-AHSL降解酶。
19 宏基因组方法挖掘增强微生物次级代谢的信号分子（Mining Microbial Signals for Enhanced Biodiscovery of Secondary Metabolites）
本章详细描述了如何通过构建宏基因组文库方法来检测和分离环境中群感效应的信号分子。
宏基因组方法挖掘群感效应信号分子的流程
参考文献
[1]Handelsman J, Rondon M R, Brady SF, et al. Molecular biological access to the chemistry of unknown soilmicrobes: a new frontier for natural products[J]. Chemistry & biology,1998, 5(10): R245-R249.
[2] 魏子艳, 金德才,邓晔.环境微生物宏基因组学研究中的生物信息学方法[J].微生物学通报,2015, 42(5): 890-901.
[3] Metagenomics[B]. Methods inMolecular Biology, 2017, DOI 10.1007/978-1-4939-6691-2.
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