宏基因組學(又稱元基因組學，Metagenomics)，是環境樣品中所有微生物基因組集合的研究技術和方法
[1]。根據分析對象和實驗目的，環境微生物的宏基因組研究基本上可以分為三類：核糖體rDNA的分類和鑑定（如原核16S rDNA、真菌18S / 28S rDNA、ITS等）、功能基因的多樣性和分類分析(如固氮還原酶nifH基因、氨單加氧酶amoA基因等)，以及全部宏基因組DNA的整體測序和分析等。從實驗手段來看，目前宏基因組研究主要以高通量檢測技術為主，部分研究也採用基因芯片技術[2]。隨著高通量測序價格的持續走低，基於宏基因組測序的微生物生態學研究逐漸增多。宏基因組測序技術可以繞開“大部分環境微生物不可培養”的壁壘，不僅可以
獲得微生物群落的多樣性和功能組成，還可以此結果為依據，發掘環境中新的功能酶或基因，可謂是將微生物分類-功能組成-應用開發結合了起來，因此其在目前環境微生物學研究中佔據主導地位。Springer出版社自2010年發表第一版以“Metagenomics”為題的宏基因組學研究方法指導書以來，又在此基礎上總結了宏基因組學研究的最新進展和方法，於2017年發表了第二版“Metagenomics”指導書。全書共包括19個章節，詳述了環境樣本的DNA / RNA提取、宏基因組文庫構建、活性微生物宏基因組研究、植物內生菌研究、基於宏基因組的數據挖掘及後期功能酶或基因的表達、篩選等具體實例、步驟和方法，是難得的宏基因組學研究寶典。
盧瑟菌將該書19個章節的目錄翻譯成中文並作了簡要介紹，讓我們一起來了解下這本書的主要內容吧（按章節排序）：
1 小片段和大片段宏基因組文庫構建（Construction of Small-Insert and Large-Insert Metagenomic Libraries）
本章詳述了基於plasmids和fosmids質粒的短片段與長片段宏基因組文庫構建方法。
2 海水樣品總DNA、RNA提取及用以Marker基因研究的通用模板cDNA合成（Extractionof Total DNA and RNA from Marine Filter Samples and Generation of a cDNA asUniversal Template for Marker Gene Studies）
本章詳細描述了一種從海水樣本中同時提取DNA和RNA的方法，並詳述瞭如何將RNA用通用引物合成cDNA以進行後續marker基因的研究。
3 海洋宏基因組大插入片段文庫的構建及篩選（Constructionand Screening of Marine Metagenomic Large Insert Libraries）
本章介紹了從海水樣本採集、DNA提取、宏基因組文庫構建到基於序列和功能的宏基因組篩選的詳細步驟。
4 低溫和鹼性極端環境下宏基因組文庫的構建及篩選（Constructingand Screening a Metagenomic Library of a Cold and Alkaline Extreme Environment）
本章以格陵蘭島南部常年低溫（<6℃）、高pH（>10）極端海洋環境中的方解石柱為樣本，詳述了樣本DNA提取、宏基因組文庫構建及耐低溫、高pH活性酶的篩選步驟。
5 DNA、RNA、蛋白質穩定同位素探針（SIP）結合宏組學分析微生物群落活性（DNA-,RNA-, and Protein-Based Stable-Isotope Probing for High-Throughput Biomarker Analysis of Active Microorganisms）
本章詳述了用穩定同位素探針（SIP）結合宏組學方法（宏基因組/轉錄組/蛋白組）方法，從DNA、RNA、蛋白質三個層面研究環境微生物的代謝活性。
穩定同位素探針（SIP）結合宏組學研究微生物活性策略流程
6 植物內生細菌、真菌多樣性評估（Assessing Bacterial and Fungal Diversity in the Plant Endosphere）
研究植物內生菌的一個難點是如何排除來自宿主基因組的汙染問題，本章詳細介紹了通過高度特異性引物擴增的方法排除宿主基因汙染的內生菌多樣性研究策略，從植物樣本處理、核酸提取、PCR擴增到高通量測序及後期數據分析都進行了詳盡地描述。
7 複雜微生物群落中植物軟腐腸桿菌科宏基因組測序分析（Shotgun Metagenomic Sequencing Analysis of Soft-RotEnterobacteriaceae in Polymicrobial Communities）
本章主要講述瞭如何通過宏基因組測序手段分析誘發植物軟腐病的腸桿菌科病原菌，其中也提到了一種細菌DNA富集方法，可有效降低來自真核宿主的基因汙染。
宏基因組測序後數據分析流程
8 變鉛青鏈黴菌中宏基因組DNA的克隆、表達及後續發酵條件優化（Cloning and Expression of Metagenomic DNA inStreptomyces lividansand Subsequent Fermentation for Optimized Production）
變鉛青鏈黴菌是常用的革蘭氏陽性表達宿主之一，本章詳述瞭如何以其為宿主對環境宏基因組中的DNA進行克隆、表達，並介紹了基於宿主的發酵條件優化方法。
9 基於宏基因組數據指導的降解網絡重構（Degradation Network Reconstruction Guided by Metagenomic Data）
本章詳細介紹瞭如何從環境宏基因組數據中挖掘有機物降解相關的基因，並根據數據庫對有機底物的代謝過程作出預測，構建基於環境樣品宏基因組數據的降解代謝網絡。
基於兩組不同樣品宏基因組數據構建的芳香烴代謝網絡圖
10 基於宏基因組的功能基因表達新工具（Novel Tools for the Functional Expression of Metagenomic DNA）
基於宏基因組文庫的功能基因表達受限於多種因素（如靶基因轉錄或翻譯效率低、因缺乏合適分子伴侶或輔因子而使得蛋白錯誤摺疊或組裝等），一個有效提高基因表達成功率的方法是採用不同的宿主菌。本章詳述瞭如何在五種不同宿主菌（Escherichiacoli,Pseudomonas putida,Bacillus subtilis,Burkholderia glumae,Rhodobacter capsulatus）中表達宏基因組測序獲得功能基因的方法。廣宿主穿梭載體在不同宿主菌中的使用，使基於活性的宏基因組DNA篩選成為現實。另外，本章還介紹了一種最新的轉移-表達系統（TREX），可實現大的功能基因簇在不同物種中的表達。
11 基於微量滴定板方法高通量地篩選文庫中活性、立體選擇性的水解酶 （A Microtiter Plate-Based Assay to Screen for Active and Stereoselective HydrolyticEnzymes in Enzyme Libraries）
本章詳述瞭如何用微量滴定板法高通量地篩選宏基因組文庫中有活性和不同立體選擇性的酯酶等水解酶的詳細方法。
基於微量滴定板方法的宏基因組文庫活性水解酶篩選流程
12 基於宏基因組文庫的纖維素酶篩選（Screening for Cellulase Encoding Clones in Metagenomic Libraries）
纖維素酶在生物乙醇生產、紡織業等領域有重要的應用，本章詳述瞭如何基於宏基因組文庫篩選適應不同條件的高效纖維素酶。
13 基於宏基因組文庫的木質纖維素酶液相多通路高通量篩選（Liquid Phase Multiplex High-Throughput Screening of Metagenomic Libraries Using p-Nitrophenyl-Linked Substrates for Accessory Lignocellulosic Enzymes）
本章詳述了基於宏基因組文庫並結合液相多通路方法，可實現三種木質纖維素酶（β-glucosidases, β-xylosidases, α-L-arabinofuranosidases）同時高通量篩選。
基於宏基因組文庫的木質纖維素酶液相高通量篩選方法流程
14 基於宏基因組文庫的多酚類修飾糖基轉移酶篩選 （Screening Glycosyltransferases for Polyphenol Modifications）
糖基轉移酶在很多藥物的糖基化修飾中有重要作用，本章詳述了一種基於宏基因組篩選克隆是否發生糖基化修飾的新方法，該方法也可用於研究其他類型的修飾，如甲基化等。
15 複雜微生物群落中分離編碼新型PHA代謝酶基因的方法（Methods for the Isolation of Genes Encoding Novel PHA Metabolism Enzymes from Complex Microbial Communities）
PHA（聚羥基脂肪酸）是一類微生物聚酯，在生物塑料生產等領域有廣泛的前景。本章詳細介紹瞭如何根據宏基因組文庫從複雜的微生物群落中分離PHA代謝途徑中相關酶基因的方法。
16 基於功能宏基因組文庫的磷酸酶活性編碼基因的篩選和異源表達（Function-Based Metagenomic Library Screening and Heterologous Expression Strategy for Genes Encoding Phosphatase Activity）
磷酸酶在食品加工、生物修復、醫學診斷等領域有廣泛應用，本章詳細介紹了基於宏基因組文庫篩選並異源表達活性磷酸酶編碼基因的方法。
17 基於宏基因組文庫的活性氫化酶篩選（Activity-Based Screening of Metagenomic Libraries for Hydrogenase Enzymes）
氫化酶不僅在生物代謝中有重要作用，也可催化質子產生氫氣，在清潔能源開發中有巨大潛力。本章詳述瞭如何通過宏基因組手段篩選高活性氫化酶的過程。
基於宏基因組文庫的[NiFe]-氫化酶篩選流程
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基於宏基因組的N-AHSL信號干擾酶的篩選（Screeningfor N-AHSL-Based-Signaling Interfering Enzymes）群感效應（Quorumsensing，QS）是指細菌根據密度變化，通過釋放小分子信號物質，對自身或其他菌群的基因表達進行調控的現象。其大致過程為：細菌向胞外分泌自誘導信號分子（autoinducer，AI）；AI分子在體外積累到一定閾值，就與細菌表面、膜上或胞內的特定受體結合，從而改變胞內基因表達，參與多種生理、病理過程，如細菌的群集運動、抗生素抗性、細菌致病性等。N-AHSL就是群感效應中一種重要的信號分子，與某些病原菌的致病性密切相關。本章介紹瞭如何通過環境樣品的宏基因組文庫方法篩選N-AHSL降解酶。
19 宏基因組方法挖掘增強微生物次級代謝的信號分子（Mining Microbial Signals for Enhanced Biodiscovery of Secondary Metabolites）
本章詳細描述瞭如何通過構建宏基因組文庫方法來檢測和分離環境中群感效應的信號分子。
宏基因組方法挖掘群感效應信號分子的流程
參考文獻
[1]Handelsman J, Rondon M R, Brady SF, et al. Molecular biological access to the chemistry of unknown soilmicrobes: a new frontier for natural products[J]. Chemistry & biology,1998, 5(10): R245-R249.
[2] 魏子豔, 金德才,鄧曄.環境微生物宏基因組學研究中的生物信息學方法[J].微生物學通報,2015, 42(5): 890-901.
[3] Metagenomics[B]. Methods inMolecular Biology, 2017, DOI 10.1007/978-1-4939-6691-2.
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