写在前面
对于体细胞治疗而言，免疫细胞的基因工程改造是达到疗效和实现安全性的关键。近年来，随着自体细胞疗法在商业化进程中取得了前所未有的突破，以及前沿科学的迅速进展，各种全新的免疫细胞构建也在不断涌现，并在不断推动中进入临床研究，让人们看到了巨大的潜力和广阔的前景。
然而，目前似乎仍然很难判定，细胞治疗已经逐步迈向成熟的产业化进程，其最主要的原因就在于对于这类异质性程度较高的细胞制品，很难找到一个通用的标准去衡量一个工艺的有效性。
笔者认为，所谓异质性有多种角度去理解，其一是病人自身的异质性，其二是免疫细胞本身的异质性（如处于不同的分化状态），其三是基因改造的异质化（如基因编辑本身的随机性）。无论是自体疗法或是异体疗法工艺，在宏观到微观的层面，都不可避免存在着不同程度的异质性，而近年来已经有很多研究已经发现，相比较其他生物制品，在细胞本身作为一种药品的前提下，这些不同层级的异质性均有一定的疗效相关性。更为重要的是异质性会让工艺本身的目标和范围显得模糊，进而影响工艺过程控制的不确定性。
本文关注免疫细胞本身的异质性，主要探讨免疫细胞激活，分化与代谢表现之间的关系，并期望从这一角度，能进而引起更多关于如何从过程代谢表现来预测细胞异质性的思考。
糖代谢切换与免疫细胞激活
糖代谢切换在很多细胞培养过程中都可以观察到，最为典型的如，葡萄糖消耗速率的突然下降，乳酸从生成转为消耗等。在一些工艺过程中，这些代谢切换往往与过程有效性有密切关联。同样，免疫细胞的代谢特点在很多疾病（如癌症）研究中已经被广泛探讨，并形成了很多规律性的认识。我们很难说，免疫细胞（有时往往在肿瘤环境中）在体内的代谢切换，是一种instructive（指导性），还是一种responsive（响应性），但这些联系的存在，对于体外培养免疫细胞而言，可能是非常有意义的信息。
图一.The Metabolic Phenotype of Quiescent and Activated T Cells
一些研究发现，由CD28/CD3通路介导的T细胞激活信号，会引起糖酵解速率的迅速提高，具体表现为显著的葡萄糖消耗和乳酸生成，偏向于有氧糖酵解的表现（Aerobic glycolysis）。而要实现这种显著提高的糖酵解水平，T细胞会迅速表达与葡萄糖亲和力最强的GLUT1转运蛋白。在一些研究中也发现，仅仅通过TCR/CD3或CD28通路激活并不能引起显著的GLUT1过表达，只有在共刺激条件下，才能显著地观察到GLUT1的高表达。高表达的GLUT1直接关联高葡萄糖消耗速率，同时也观察到显著的乳酸生成，表现为典型的有氧糖酵解（Aerobic glycolysis）。
T细胞激活后的快速扩增以大量的能量需求为前提，在限制性葡萄糖浓度条件下，有氧糖酵解转变为完全氧化磷酸化（OXPHOS）以产生“足量”ATP，且依然维持较高的糖酵解速率，并支持细胞快速分裂，说明T细胞在一定的激活信号下，确实有着某种自调节（homeostatic ability）的特质。从这点上来看，免疫细胞（如T细胞）代谢切换似乎更像是一种对外在条件变化的响应（response），同时也是对细胞生长的一种指示（instruction）。
另外需要指出的是，免疫细胞的代谢表现，有时候会是一种更上游的信号，并非仅仅影响细胞扩增。在一种线粒体电子链传递复合物缺失的小鼠T细胞中，就无法实现抗原特异性激活，而只能通过活化T细胞核因子（NFAT）来实现激活扩增。由此来看，很难说糖代谢切换（从有氧糖酵解到完全氧化磷酸化）与T细胞的激活，一定是某种因果关系或是相关关系，但越来越多的研究已经证实，通过调节代谢的转换，可以影响或控制免疫细胞的一些行为，例如激活或分化，而这些研究也为过程控制的有效实施提供了有价值的理论基础。
糖代谢切换与免疫细胞分化
免疫细胞如T细胞在激活后的分化导致了其在细胞层面的异质性。对如CAR-T细胞治疗而言，目前尚无定论，究竟何种分化程度的T细胞能引起持续的疗效，但学界似乎更乐于接受一个较少分化程度的记忆亚群。
图二.Cell Fate and Function in the Immune System Is Supported by the Engagement of Metabolic Pathways
不同分化程度的T细胞亚群，从转录水平，到蛋白水平，再到细胞功能上都有着截然不同的表现。同时，它们的代谢水平也与以上有着密切关联。众多研究揭示了记忆性T细胞和效应性T细胞的在代谢水平上的差异。相较于效应性T细胞，记忆性T细胞在激活扩增后，完全氧化磷酸化水平显著提高，具体体现在更高的氧气消耗，更多的线粒体生成和维持。与效应性T细胞的扩增更多依赖于糖酵解，或大量消耗葡萄糖不同，记忆性T细胞似乎更多依赖于脂肪酸的氧化，但同样能保持不低的糖酵解速率，因此即使在与肿瘤共存的营养物限制环境中，依然能高效合成ATP和进行物质代谢，以维持快速的细胞生长。
近年来许多研究指出，记忆性T细胞的这种代谢特点，并非完全是对外在环境变化的一种响应。一些转录水平的分析都发现了代谢表现在基因层面上的痕迹，其更可能是这一类细胞亚群的“天然”属性。
图三.Model Relating Metabolic State of Different T Cell Subsets to Cell Function
对于不断分化中的T细胞动态进程，代谢调控似乎也能起到了一定调控其亚群分布的作用。在体内免疫应答中观察到的记忆性T细胞，在受到强制性有氧糖酵解条件维持下，其并没有被清除，而是转而形成更多的效应性亚群。在体外培养的情况亦是如此，当使用葡萄糖结构类似物阻断实际的糖酵解时，分化成效应性亚群的能力被显著地抑制，从而观察到低分化程度亚群比例的提高。
越来越多的研究认为，免疫细胞例如记忆性T细胞在分化进程中存在着可调控的窗口，其理论基础来源于这类细胞在转录水平上同时表达了记忆性和效应性的双重特征。无论是在体内免疫环境的作用下，还是在体外短暂的“控制”环境下，都存在改变其最终分化命运的途径。换而言之，过程控制可以是积极有效的，而非被动的，只是目前还并不清楚控制能及的程度，以及这些调控如何影响细胞最终发挥杀伤功能和长期续存的能力。
正如本文最初提及的，免疫细胞的高异质性使工艺开发遭遇了前所未有的挑战，但从另一方面而言，这种“混合”状态有可能也使其应用于免疫治疗的多样性成为可能。从工艺开发角度，界定范围是一切控制策略的起点和关键，否则就无法衡量过程的稳健性。当然，对于细胞治疗的工艺过程而言，也许需要去关注过程表现更上游的指标，代谢水平是否可以作为一种新的indicator，还需要更多时间和努力去验证。
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