1、蛋白轉移不到膜上，但膠上有，同時 Marker 轉上去了，為什麼？
答：可能是：a)樣品濃度過低；b)轉移時間不夠。
2、磷酸化抗體的檢測樣本製備時是否一定要加 NaF 等？
答：NaF 是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時候是不用加的。
3、要驗證某個細胞上有無該蛋白的存在，需要做免疫組化和 westernblot 試驗嗎？做這兩個試驗時的一抗和二抗可以共用嗎？
答：①免疫組化可以用來進行定位，但是不能精確定量，而且有時會有假陽性，不易與背景區分；Westernblot可以特異性檢測某個蛋白質分子，進行定量，但是不能定位。②兩種實驗的一抗有時候不能通用，公司的產品說明一般都會說明可以進行什麼實驗，在免疫組化時，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。
4、做 WesternBlot 時，提取蛋白後凍存（未加蛋白酶抑制劑），用的博士德的一抗，開始還有點痕跡，現在越來越差，上樣量已加到 120μg，換了個 santacloz 的一抗仍不行。是什麼原因？蛋白酶抑制劑單加 PMSF行嗎？
答：懷疑是樣品問題，可能是：1，樣品不能反覆凍融；2，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時，建議檢查 WesternBlot過程，提高一抗濃度。對於加蛋白酶抑制劑來說，一般加 PMSF 就可以了，最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑。
5、細胞水平要做 westernblot，多少細胞提的蛋白夠做 westernblot？
答：一般 5×10^6 就足夠了。
6、同一樣品能同時提 RNA 又提蛋白麼？這樣對 westernblot 有無影響？
答：能，沒有問題。
7、同一蛋白樣品能同時進行兩種因子的 WesternBlot 檢測嗎？
答：當然可以，有的甚至可以同時測幾十種樣品。
8、如果目標蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什麼？
答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑要溫和得多，這時最好加上 NaF 去抑制磷酸化酶的活性。
9、我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到 1 微克，但是在轉膜時經常會發現只有一部分蛋白轉到了膜上，就是在轉膜後染膠發現有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，有什麼辦法可以解決？
答：你可以加大上樣量，沒有問題，還有轉移時你可以用減少電流延長時間，加 20％甲醇。
10、想分離的蛋白是分子量 200kd 的，SDS-PAGE 電泳的分離膠濃度多大合適？積層膠的濃度又該用多少？這麼大分子量的蛋白容易作 WesternBlot 嗎？
答：200kd 的蛋白不好做，分離膠用 7％，積層膠 3.5％。
11、如果上樣量超載，要用什麼方法來增加上樣量？
答：可以濃縮樣品，也可以根據你的目標分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載 30％是不會有問題的。如果已經超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試 1.5mm 的。
12、蛋白變性後可以存放多久？
答：－80℃，一兩年沒有問題。最關鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細菌消化掉(也是被酶水解了)。
13、我所測定的蛋白分子量是 105KD，按理說分離膠應當採用 7.5%，但資料卻要求分離膠和濃縮膠均採用11％的配方，不知為何？
答：上述提到的兩種凝膠均可以使用，因為 105KD 的蛋白在上述兩種膠的線性分辨範圍內，但需注意條帶位置。
14、二抗是生物素化的抗體，三抗是親和素生物素體系，不知採用這樣的方案後，封閉液是否
要作調整，能否再用 5％的脫脂奶粉呢？好像有資料說脫脂奶粉會影響親和素生物素的生成，是嗎？
答：不能使用脫脂奶粉，因為脫脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替應該好一點．
15、問一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達量有關係嗎？
答：WesternBlot 一般上樣 30－100 微克不等，結果跟目的蛋白的丰度、上樣量、一二抗的量和孵育時間都有關係，也與顯色時間長短有關。開始摸條件時，為了拿到陽性結果，各個步驟都可以量多一點時間長一點，當然背景也就出來了。要拿到好的結果，如果抗體好的話比較容易，抗體不好的話就需要反覆地試了，當然有的不適合 WesternBlot 的怎樣做也不行。
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