使用的國家和參與的戰役
英軍
1940年初，英國本土及駐守埃及的部分部隊均已開始裝備瑪蒂爾達二型坦克。
至於瑪蒂爾達二型坦克參與的第一場戰鬥，是1940年5月的法國戰役。第七皇家坦克團的23輛瑪蒂爾達二型坦克，在戰場上有不錯的表現。瑪蒂爾達二型坦克的設計證實比瑪蒂爾達一型坦克好多了：瑪蒂爾達二型的火力遠優於只有一挺機槍的一型，二型坦克的懸吊及行動系統也比較可靠。瑪蒂爾達二型坦克擁有在當時來講非常厚重的裝甲，能夠抵禦當時德軍最主要的反坦克炮PaK 36反坦克炮。[4] B1重型坦克及瑪蒂爾達二型坦克等厚裝甲坦克的出現，對前線德軍構成了壓力，也讓德軍意識到已有反坦克武器的不足。為此，德軍開始把現成的88毫米高射炮用於反坦克作戰，其優異的反坦克能力因而嶄露頭角。
埃及駐軍方面的瑪蒂爾達二型坦克經歷了大部分的北非戰役。北非戰役初期，瑪蒂爾達二型坦克於脆弱的意大利部隊陣前所向披靡。除非使用重型火炮，否則意軍幾乎無法利用現有武器擊毀瑪蒂爾達二型坦克。不過戰場上部分瑪蒂爾達二型即使被意軍100mm榴彈炮以高爆彈直接命中，也沒有嚴重的損傷 。
但瑪蒂爾達二型坦克在德意志非洲軍的88毫米高射炮的面前不堪一擊，往往還沒進入坦克炮的射程，就被88炮逐一擊毀。而且瑪蒂爾達二型坦克炮塔空間有限，改造能力有限，沒法換裝以提升火力。大部分瑪蒂爾達二型坦克如同同期其他英軍坦克一樣，都裝備2磅炮（Close Support 近戰支援型例外）。2磅炮是一種優良的反坦克炮，但早期英軍嚴重缺乏供2磅炮使用的高爆彈。即使有，該高爆彈威力十分有限，遠不及M4謝爾曼的75mm炮。而作為步兵支援的步兵坦克最為重要的就是其火力，尤其是使用高爆彈時的火力。至於安裝3英寸榴彈炮的近戰支援（Close Support）型的高爆彈威力雖較2磅炮好，但仍不如M4謝爾曼；而且安裝3英寸榴彈炮後原本空間有限的炮塔就更加狹窄。瑪蒂爾達二型坦克很快就落後了，且在1942年中開始退役。不過坦克底盤仍然應用在其他方面。
如同其他北非戰役中的英軍坦克，一小部分的瑪蒂爾達二型坦克被德軍俘獲，在德軍中服役直到被擊毀或出現故障。這些俘獲的坦克對資源不足的德軍來講是戰力的補充。
蘇聯紅軍
1184輛瑪蒂爾達二型坦克因租借法案而提供給蘇聯。其中252輛在海上運輸時因德軍潛艇襲擊而損失。
蘇聯官方對瑪蒂爾達二型坦克等透過租借法案進口的西方坦克評價較差，認為進口的英國坦克遠遜俄國國產的T-34及KV-1。事實上俄國坦克兵對此型坦克的評價也僅為一般。不滿在於威力過小的主炮及易在東歐嚴冬中被冰雪及泥土凍結的懸吊系統。
即便性能一般，瑪蒂爾達二型坦克仍被將就使用，在蘇軍中長期服役作步兵支援用。部分瑪蒂爾達二型坦克裝上了蘇軍的76.2mm火炮以加強火力，不過火力依然有限。
太平洋戰爭
英聯邦部隊如澳大利亞軍，有裝備到一些瑪蒂爾達二型坦克。瑪蒂爾達二型坦克在太平洋戰爭中第一次有記錄的作戰，是1943年的休恩半島之戰。因為日軍極為缺乏有效的反坦克武器，所以瑪蒂爾達二型坦克如同同期的M4謝爾曼坦克一樣，成為日軍難纏的對手。除了數量有限的重型火炮外，步兵的自殺式襲擊成為比較常見及有一定效果的反擊方式。
至此，瑪蒂爾達二型坦克成為英軍唯一一款經歷整個二戰的坦克，從1940年5月的法國戰役到1945年結束的太平洋戰爭。
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