間充質幹細胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是一類存在於多種組織(如骨髓、臍帶血和臍帶組織、胎盤組織、脂肪組織等），具有多向分化潛力的成體幹細胞。
它可以向多種間充質系列細胞（如成骨、成軟骨及成脂肪細胞等）或非間充質系列細胞分化。
間充質幹細胞具有低免疫原性，一般都不會引起宿主的免疫反應。這種特性使其在自身免疫性疾病以及各種替代治療等方面具有廣闊的臨床應用前景。
1. 間充質幹細胞來源與分佈
2. 間充質幹細胞的定義
3. 間充質幹細胞生物學特性
4. 間充質幹細胞的免疫調節作用
5. 間充質幹細胞的細胞表面標記物
6. 間充質幹細胞的應用
1. 間充質幹細胞來源與分佈
間充質幹細胞是1987年由Friedenstein等人[1]利用自然貼壁法從獲得的骨髓基質細胞中發現的。間充質幹細胞（MSCs）的概念最早在1991年由Caplan提出。
MSCs這一類群細胞的異質性比較大，故無法定MSCs的發育起源。比如牙髓、皮膚等屬於外胚層來源，骨髓、脂肪組織、圍產期組織等則屬於中胚層來源。
間充質幹細胞廣泛存在於人體各組織中，可來源於骨髓，胰腺，皮膚肺等多處器官組織。也在許多其他的組織中發現有間充質幹細胞的存在，在滑膜、肝臟、肺臟、牙周質、胰腺、眼結膜、脂肪、肌腱、甚至在羊水及頭皮組織中均可以培養出間充質幹細胞。
圖1 間充質幹細胞的來源
2. 間充質幹細胞的定義
自1991年MSCs的概念提出之後，在接下來的十年內報告MSCs的組織類型激增。這就需要對MSCs的定義有一個明確的標準。
2006年，國際細胞療法協會（ISCT）制定了MSCs的定義的基本標準，也是MSC最低的鑑定標準：
- 在標準體外培養條件下呈貼壁生長狀態。
- 大於或等於95%的細胞表達CD105、CD73和CD90，且表達CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19或HLA-Ⅱ類分子的細胞不應超過總數的2%[2]
- 在體外誘導條件下，具有分化為成骨細胞、軟骨細胞及脂肪細胞的能力。
該標準存在的缺陷是對其在體內實驗是否能真正分化未做要求，也沒有檢驗其乾性是否能維持。
不同來源的MSCs分子特徵差異巨大[3]。Caplan建議將其改為醫用信號細胞 (medicinal signaling cells，MSCs)[4]。
3. 間充質幹細胞生物學特性
間充質幹細胞是一類能夠自我更新並具有多向分化潛能的典型細胞群體。在體外和體內通過不同方式誘導分化為脂肪組織細胞、軟骨組織細胞、結締組織細胞和骨組織細胞及神經幹細胞。此外，研究表明，MSCs也可能被誘導分化為內胚層細胞（肺細胞，肌細胞和腸上皮細胞）及外胚層細胞（上皮細胞和神經元）[5] [6]。
間充質幹細胞具有獨特的細胞因子分泌功能，可分泌IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、幹細胞生長因子、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、TGF-β等。
除了具有分化潛能外，間充質幹細胞具有低免疫原性和免疫調節作用。
間充質幹細胞免疫調節機制可由分泌可溶性細胞因子如IL-10、TGF-β1、前列腺素E2、肝細胞生長因子、IL-2等介導。誘導CD8+調節性T細胞發揮免疫抑制作用。人骨髓間充質幹細胞可能干涉抗原呈遞細胞的成熟。
圖2 間充質幹細胞的自我更新和多向分化潛能
4. 間充質幹細胞的免疫調節作用
MSCs對免疫系統的作用以負向調控為主。
- 單核細胞：單核細胞可分化為M1型Mφ起促炎作用或分化為M2型Mφ起抗炎作用。MSCs分泌IL-1RA、IL-10、CCL-18促使M1向M2轉化，通過影響Treg的形成，起到抗炎症與負向調節T細胞功能的作用。
- 中性粒細胞：在體內，MSCs能夠通過加強中性粒細胞抗菌能力起到輔助清除細菌的作用，此外還能抑制中性粒細胞凋亡，延長中性粒細胞壽命。
- 樹突狀細胞：作為體內最主要的專職抗原提呈細胞，樹突狀細胞能夠有效刺激T細胞和B細胞的活化，激發機體免疫應答。體外實驗證實MSC能夠顯著地減少單核細胞向樹突狀細胞的分化，維持樹突狀細胞的未成熟的狀態，從而使DC不能有效地活化初始T細胞和刺激T細胞增殖。
- T細胞：MSCs主要通過釋放可溶性因子、細胞間的直接接觸以及誘導Treg生成等三種方式抑制T細胞功能，這種抑制作用呈劑量依賴效應。
- B細胞：MSCs會分泌一種細胞因子抑制B細胞增殖。MSCs通過使B細胞的細胞週期滯留在G0/G1期來達到目的。MSCs能夠產生趨化因子受體CXCR4/5/7來改變B細胞的趨化能力。
圖3 間充質幹細胞的免疫調節作用
5. 間充質幹細胞的細胞表面標記物
細胞的特定的功能與其表面標誌物相關，細胞表面標記物可以體現細胞的一些基本特徵[7]。間充質幹細胞屬混雜細胞群，其表面抗原也具有非專一性，表達了間質細胞、內皮細胞和表皮細胞的表面標誌。目前人類間充質幹細胞表面比較肯定存在的標記物有CD10，CD13，CD29，CD90和CD1，表面陰性的為CD14，CD34，CD45[8] [9]。
圖4 間充質幹細胞陽性和陰性標記
CD29：CD29也被稱為整合素β1,VLA-β鏈或gpIIa，為多種細胞外基質蛋白的受體，是分子量為130 kDa的單鏈I型糖蛋白，屬於整合素家族。它廣泛表達於大多數造血細胞和非造血細胞，包括白細胞(雖然在粒細胞水平較低)、血小板、成纖維細胞、內皮細胞、上皮細胞和肥大細胞。CD29作為纖維連接蛋白受體，參與多種細胞-細胞和細胞-基質相互作用，調節多種重要的生物學功能，包括胚胎髮育、傷口修復、止血和防止細胞程序性死亡。它的表達與MSC的遷移有關。
CD44：CD44也稱為Hermes、Pgp1、H-CAM或Hutch，是一種80-95 kDa的糖蛋白。它表達於白細胞、內皮細胞、肝細胞和間充質細胞。CD44在B和T細胞的記憶階段高表達，被認為是一個有價值的記憶細胞亞群的標誌物。
CD44是一種粘附分子，CD44抗原是一種細胞表面糖蛋白，CD44參與多種細胞功能，包括淋巴細胞活化、再循環和歸巢、造血和腫瘤轉移。
CD54：CD54也稱為ICAM-1，是一種分子量為85-110 kDa的I型跨膜蛋白，是免疫球蛋白超家族的成員。它表達於活化的內皮細胞、高內皮微靜脈、T、B細胞、單核/巨噬細胞、粒細胞和樹突狀細胞。ICAM-1的表達可從細胞表面釋放。CD54可由IL-1和TNF-α誘導，並由血管內皮細胞、巨噬細胞和淋巴細胞表達。CD54在細胞粘附中發揮作用，並參與炎症和白細胞外滲。CD54也被證明是鼻病毒的主要細胞受體。
CD73：CD73是一種5′-核苷酸外切酶，又稱NT5E。它是一種69 kDa GPI錨定的表面蛋白。CD73廣泛表達於包括淋巴細胞、內皮細胞、平滑肌細胞、上皮細胞和成纖維細胞在內的多種細胞。CD73不僅可參與嘌呤核苷酸的補救合成途徑，還可作為一種重要的免疫信號分子，參與跨膜信號轉導及細胞的黏附。CD73在間充質幹細胞表面的穩定表達是鑑別MSCs重要的表面標記之一。
CD90 (Thy1)：CD90也稱為Thy-1，是一種25-35kDa 的GPI錨定蛋白。它屬於免疫球蛋白超級家族。人CD90表達於神經細胞、CD34+細胞亞群、胎肝細胞亞群、胎胸腺細胞亞群、成纖維細胞、活化內皮細胞和某些白血病細胞系。Thy-1與與細胞的黏附、分化、細胞間相互作用有關。它是人類微血管內皮細胞活化的標記，與新生血管的形成有關[10]；也是鑑別人類MSCs的重要標記之一[11]。
CD105 (Endoglin)：CD105也稱為endoglin，是透明帶蛋白(ZP)家族的一種90 kDa的I型跨膜糖蛋白糖蛋白。
Endoglin在足月胎盤增生的血管內皮細胞、軟骨細胞和合體滋養層細胞上高表達，在造血幹細胞、間充質幹細胞和神經嵴幹細胞、活化的單核細胞以及淋巴和髓系白血病細胞上表達較少。在血管生成的組織中，如腫瘤、傷口癒合或真皮炎症中，CD105在活化的內皮細胞上的表達增加。Endoglin是TGFβ超家族配體的III型受體。CD105在血管發生發展過程中起著重要的作用，它可以維持血管的完整性[12]。
CD106 (VCAM-1)：CD106又稱血管細胞黏附蛋白1(VCAM1)，INCAM-100和L1CAM，其編碼的蛋白是唾液酸糖蛋白，分子量為110kDa，由IL-1、TNF等細胞因子激活表達。
它是免疫球蛋白超家族成員，表達於炎症血管內皮細胞、巨噬細胞樣細胞和樹突狀細胞上均有表達，在正常組織和炎症組織中均有表達。它的表達與MSC的乾性維持有關[13]。
CD106介導白細胞-內皮細胞粘附和信號轉導，可能在動脈粥樣硬化和類風溼性關節炎的發生發展中起作用。
CD166 (ALCAM)：CD166又稱CD6配體或活化的白細胞粘附分子(ALCAM)，屬於免疫球蛋白超家族成員，是一種分子量為100-105kD的跨膜糖蛋白。
它表達於活化的T細胞、活化的單核細胞、上皮細胞、成纖維細胞和神經元。ALCAM/CD6相互作用可能參與T細胞的發育和調節。此外，ALCAM/CD6和ALCAM/NgCAM相互作用可能在神經系統中發揮作用。ALCAM在高轉移性黑色素瘤細胞系中表達上調，並可能在腫瘤遷移中發揮作用。它還可以參與胚胎造血系統的發育和毛細血管的形成，並在維持MSCs多向分化潛能方面起著至關重要的作用[14]。
CD349 (Frizzled-9)：CD349屬於“捲曲”基因家族的成員，這些蛋白是Wnt信號蛋白的受體。FZD9基因位於7號染色體的Williams綜合徵常見缺失區，FZD9基因的雜合性缺失可能與Williams綜合徵的表型有關。FZD9主要在腦、睪丸、眼睛、骨骼肌和腎臟中表達。
STRO-1：Stro-1也是研究常用的標誌物，但在很多研究中均未提及[15]。
作為尋找間充質基質/幹細胞(mesenchymal stromal/stem cells，MSC)可靠標誌物的實驗研究的一部分，Stro-1抗體是利用人CD34+骨髓細胞脾內免疫小鼠產生的幾株雜交瘤中的一株產生的。Stro-1被認為是最著名的MSCs標記物，其抗體主要用於流式細胞術以及對可能的MSCs進行染色。
TNAP：TNAP(組織非特異性鹼性磷酸酶)抗原可以與W8B2抗體反應。TNAP選擇性地表達在骨髓間充質幹細胞上。
CD34：CD34是一種跨膜唾液黏蛋白，可能與黏附和抗黏附有關。它是間充質幹細胞的陰性標誌物，一直以來備受爭議[16]。爭議的點在於，分離得到的新鮮細胞（如內皮細胞）是表達CD34的，但是隨著傳代次數的增加CD34逐漸消失，造血幹細胞中也存在類似情況[17]。也就是說MSCs不表達CD34是由細胞培養所致，並不符合其在體內的真實狀態，所以是否應將CD34作為MSCs的陰性標誌物應重新考慮。
5.1 不同來源MSC的標誌物比較
目前臨床應用較多的為骨髓來源MSC（bone marrow-MSC, BM-MSC）、臍帶來源MSC（umbilical cord-MSC, UC-MSC）和臍血來源MSC（UCB-MSC），不同來源MSCs既存在一些共性，也具有一些不同的特性。
UC-MSC的大多數免疫標記物與BM-MSC的表達相似，不同的是，UC-MSC中HLA-ABC和CD106的表達低於BM-MSC。這提示UC-MSC比BM-MSC具有更低的免疫原性。CD106的低表達可能是UC-MSC與BM-MSC的鑑別點之一。
UCB-MSC和BM-MSC細胞表面標誌物比較一致。它們均表達CD29、CD44及CD105等細胞黏附分子，而不表達CD13、CD14、CD34及CD45，其免疫表型不隨著細胞傳代的增加而改變。
6. 間充質幹細胞的應用
間充質幹細胞的特點：具有自我更新，多向分化潛能，在體外能傳40代，並保持穩定的表型和多向分化潛能。此外，它具有低免疫原性。
因此，間充質幹細胞可作為基因治療的載體細胞，修復各種組織和器官，如骨、軟骨、肌腱、皮膚、神經組織、心肌，也可用於器官或組織移植。
目前應用較多的有骨、軟骨和關節損傷的修復，造血幹細胞移植治療移植物抗宿主病，自身免疫性疾病的治療，脊髓損傷和神經系統疾病的治療。
References
[1] Friedenstein A J, Chailakhyan R K, Gerasimov U V. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers [J]. Cell proliferation, 1987, 20(3): 263-272.
[2] Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement [J]. Cytotherapy, 2006, 8(4): 315-317.
[3] Mendicino M, Bailey A M, Wonnacott K, et al. MSC-based product characterization for clinical trials: an FDA perspective [J]. Cell stem cell, 2014, 14(2): 141-145.
[4] Caplan A I. Mesenchymal stem cells: time to change the name! [J]. Stem cells translational medicine, 2017, 6(6): 1445-1451.
[5] Kopen G C, Prockop D J, Phinney D G. Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1999, 96(19): 10711-10716.
[6] Pittenger M F, Mackay A M, Beck S C, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells [J]. science, 1999, 284(5411): 143-147.
[7] Lu L L, Liu Y, Yang S G, et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials [J]. haematologica, 2006, 91(8): 1017-1026.
[8] Fakhry M, Hamade E, Badran B, et al. Molecular mechanisms of mesenchymal stem cell differentiation towards osteoblasts [J]. World journal of stem cells, 2013, 5(4): 136.
[9] Mohr S, Portmann-Lanz C B, Schoeberlein A, et al. Generation of an osteogenic graft from human placenta and placenta-derived mesenchymal stem cells [J]. Reproductive sciences, 2010, 17(11): 1006-1015.
[10] Saalbach A, Hildebrandt G, Haustein U F, et al. The Thy-1/Thy-1 ligand interaction is involved in binding of melanoma cells to activated Thy-1-positive microvascular endothelial cells [J]. Microvascular research, 2002, 64(1): 86-93.
[11] He J, Liu Y, Zhu T, et al. CD90 is identified as a candidate marker for cancer stem cells in primary high-grade gliomas using tissue microarrays [J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2012, 11(6): M111. 010744.
[12] Gerlach J C, Johnen C, Ottoman C, et al. Method for autologous single skin cell isolation for regenerative cell spray transplantation with non-cultured cells [J]. The International journal of artificial organs, 2011, 34(3): 271-279.
[13] Phelps E A, García A J. Engineering more than a cell: vascularization strategies in tissue engineering [J]. Current opinion in biotechnology, 2010, 21(5): 704-709.
[14] Laschke M W, Harder Y, Amon M, et al. Angiogenesis in tissue engineering: breathing life into constructed tissue substitutes [J]. Tissue engineering, 2006, 12(8): 2093-2104.
[15] Kolf C M, Cho E, Tuan R S. Mesenchymal stromal cells: biology of adult mesenchymal stem cells: regulation of niche, self-renewal and differentiation [J]. Arthritis research & therapy, 2007, 9(1): 204.
[16] Lin C S, Ning H, Lin G, et al. Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells? [J]. Cytotherapy, 2012, 14(10): 1159-1163.
[17] Gangenahalli G U, Singh V K, Verma Y K, et al. Hematopoietic stem cell antigen CD34: role in adhesion or homing [J]. Stem cells and development, 2006, 15(3): 305-313.
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