撰文 | 雪月
根據歐洲兒科胃腸病學肝病學和營養學會European Society for Paediatric Gastroenterology Hepatology and Nutrition (ESPGHAN)定義，小兒（<17歲）發作的腸炎為小兒腸炎（pediatric IBD，PIBD）【1】。但是小兒腸炎的症狀與經典的Crohn’s disease（CD）和ulcerative colitis（UC）不太一樣。腸鏡檢測中的大體形態、侵襲程度以及發病時長都略有不同，分類更加細緻。近幾十年來PIBD在全球範圍內呈現增長趨勢。主要原因是由於環境的改變對攜帶IBD風險基因的機體造成了較大的影響，增加了致病幾率。尤其對於小於六歲的兒童風險基因往往成為致病原因。在成人IBD（inflammatory bowel disease，炎症性腸病）中發揮重要作用的上皮間免疫細胞包括T/B細胞、ILCs、巨噬細胞和樹突狀細胞以及粒細胞在PIBD中會呈現什麼樣的變化以及風險基因造成的影響都亟待更深入的研究。
2019年11月14日，來自廣州醫科大學/廣州市婦女兒童醫療中心張玉霞、楊敏、龔四堂等與北京大學白凡課題組合作在Cell 上發表了題為“Mucosal Profiling of Pediatric-Onset Colitis and IBD Reveals a Common Pathogenesis and Therapeutic Pathway”的文章。該文章運用單細胞分析技術探究了PIBD免疫表型，風險基因對疾病的影響。作者發現各個類型的PIBD都存在環狀AMP（cAMP）信號受損。作者還發現表達PDE4B和TNF巨噬細胞的浸潤會顯著的降低上皮間T細胞的數量和血小板聚集以及5-羥色胺的釋放。作者發現給予磷酸二酯酶抑制劑dipyridamole則能夠恢復腸道免疫穩態，緩解腸炎症狀。
作者首先收集了從2016年10月到2019年4月之間進行腸鏡檢查的306名兒童的樣本。根據形態和組織學將處於靜息期的94例作為對照組，40例CD，6例UC，5例未分類IBD。剩下的161例樣本根據病理和組織評分被定義為輕度（1級）或中度/重度（2-3級）未分化結腸炎。
作者對其中的對照 (n = 6)、colitis (n = 6)、UC (n = 2)和CD (n = 3)樣本中的CD45陽性（免疫細胞）和CD45陰性（非免疫細胞）進行單細胞RNA-sequencing分析，並對免疫細胞進行了單細胞V(D)J enrichment分析。經過數據分析和質量控制，最終65367個免疫細胞和7798個非免疫細胞成功獲得轉錄組數據。分析之後這些細胞被分為9組：B cell、plasma、T＆NK cell、lymphoid-tissue-inducer cell、 Mitotic B cell、 Mitotic T cell、Fibroblast&Endothelium、 Epithelium。運用GWAS分析發現了244個基因與PIBD患病風險有關。
作者總共分析了6960個上皮細胞，並把它們分為10個亞型。作者分析和列舉了一些風險基因在上皮細胞亞型中的定位，發現不同風險基因的表達特異性較高，分別表達在幹細胞、tuft細胞或者分泌型前體細胞、腸內分泌細胞中，與上皮完整性破壞和細胞應激反應密切相關。
作者將成纖維細胞分為7個亞型。作者分析列舉了成纖維細胞亞型中特異性的與PIBD相關的基因。其中WNT2B高表達的和炎症型成纖維細胞主要參與TNF、NF-κB和應激信號通路。炎症型的成纖維細胞也高表達細胞外基質重塑相關基因。分析內皮細胞則發現在PIBD患者中內皮細胞會上調血管生成和白細胞外滲相關基因。促進調節性T細胞分化的IL33也在內皮細胞中高表達。
接下來分析髓系來源的細胞發現，髓系來源的細胞在PIBD患者樣本中數量較多，所有細胞都表達CD68，並被分為十個群體。其中4群表達CD14被定為巨噬細胞，5群被定為樹突狀細胞，另外一群是肥大細胞。macrophage-IL1Bhi/TNF+、macrophage-S100A8hiIL1Bhi/TNF+和 DC-IL1Bhi細胞在對照組樣本中未有分佈。進一步分析發現在TNF高表達的巨噬細胞中PDE4B表達量也明顯提升。PED4B會降低細胞中cAMP的含量【2】。應用臨床藥物PDE抑制劑dipyridamole處理PBMC會降低LPS誘導的炎症因子的表達，上調細胞內cAMP含量。
之後分析其他種類的免疫細胞。分析總共發現了7種CD19陽性的B細胞亞型，2種漿細胞以及16種T＆NK細胞和亞型特異性的轉錄因子。作者發現CD39-陽性的 CD8Trm和γδT 細胞在PIBD患者腸道組織丰度中顯著降低。CD39是一種膜結合的核苷酸酶，通過降解細胞外過量的ATP和ADP為AMP維持免疫穩態。CD39多表達在慢性病毒感染和腫瘤中的耗竭T細胞中【3】。
進一步探究作者發現細胞中CD39的表達與黏膜組織中ADP含量呈負相關。ADP是血小板激動劑，促進血小板累積和5-羥色胺分泌。在樣本檢測中也發現ADP和5-羥色胺呈正相關。在PIBD患者分離得到的血小板中能夠分泌更高濃度的5-羥色胺。上皮細胞間CD39陽性的T細胞的不足會通過促進血小板聚集和5-羥色胺釋放而加劇腸炎疾病程度。
綜上，PIBD患者腸道組織會浸潤高炎症水平的巨噬細胞和樹突狀細胞，CD39陽性的IET數量降低，血小板聚集明顯。這些一系列的表型的成因或許都是cAMP含量以及反應通路的降低。利用PDE抑制劑dipyridamole進行體內實驗發現，dipyridamole能夠顯著提高小鼠體重，降低疾病嚴重程度，降低血小板聚集和TNF-α的表達，升高腸道黏膜組織中cAMP含量，並減少ADP濃度。dipyridamole是一種使用於兒童的抗血小板且安全性較好的藥物。於是作者進行了8例患者的臨床實驗，並獲得了與在小鼠體內實驗一致的效果。作者接下來分析了兩種治療PIBD的傳統方法：糖皮質激素治療和抗TNF-α治療。作者發現糖皮質激素能夠抑制血小板聚集，卻不能改變TNF-α和CD39的表達。抗TNF-α藥物能夠改善疾病狀況，對免疫細胞和血小板影響較小。或許是因為抗抗TNF-α藥物靶向TNF-α下游信號。這些都表明靶向cAMP或許能顯著提升疾病相關的多種免疫相關的因素，增強治療效果，也可能能夠應用於成人IBD治療。這篇文章也樹立一個榜樣，將單細胞技術應用大放異彩，並展示了怎樣深入分析疾病中的細胞和分子能夠很好的揭示疾病的發病機制以達到治療的目標。
原文鏈接：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.10.027
參考文獻
1. Levine A, Koletzko S, Turner D, Escher JC, Cucchiara S, de Ridder L et al. ESPGHAN revised porto criteria for the diagnosis of inflammatory bowel disease in children and adolescents. Journal of pediatric gastroenterology and nutrition 2014; 58(6): 795-806; doi 10.1097/MPG.0000000000000239.
2. Gresele P, Momi S, Falcinelli E. Anti-platelet therapy: phosphodiesterase inhibitors. British journal of clinical pharmacology 2011; 72(4): 634-646; doi 10.1111/j.1365-2125.2011.04034.x.
3. Canale FP, Ramello MC, Nunez N, Araujo Furlan CL, Bossio SN, Gorosito Serran M et al. CD39 Expression Defines Cell Exhaustion in Tumor-Infiltrating CD8(+) T Cells. Cancer research 2018; 78(1): 115-128; doi 10.1158/0008-5472.CAN-16-2684.
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