解讀丨常興（中科院上海營養與健康研究院）
自從發現DNA是遺傳的物質基礎以來, 分析基因型 (DNA序列的差異)和表型（細胞、模式生物乃至人類的個體間差異）的關係, 一直是遺傳學乃至生物學研究的核心科學問題。如果可以通過高通量的方法分析這一問題，將極大地促進我們對基因功能、表達調控和及其與疾病之間的關係。利用shRNA、siRNA 以及近幾年來迅速發展的CRISPR, 高通量的敲低/敲除基因的表達, 已經被廣泛應用於高通量的研究基因功能。 但是, 和複雜性狀、人類疾病以及生物進化最相關的遺傳突變, 包括點突變 (SNP)、錯義突變、以及非編碼區突變等，往往不造成完全的功能缺失，並且很難預測其對錶型的影響。但是，這些突變一直無法高效高通量的通過實驗產生，大多數研究只能利用反向遺傳學的方法，單個誘導突變，分析其表型。
現有的CRISPR方法，極大的方便了針對DNA的遺傳操作。但因為受限於同源重組 (HDR) 的低效性，無法高效大規模產生精確的突變，用於遺傳學研究。解決這一難題，主要有兩種思路，其一，通過飽和突變的方法，隨機產生突變，但這一方法只能侷限於一小段DNA；其二，改進現有的HDR方法，提高其效率。
近日，來自斯坦福大學的
Hunter Fraser課題組在Cell上發表了題為Functional Genetic Variants Revealed by Massively Parallel Precise Genome Editing的論文，就是通過上述第二種思路，在酵母細胞中針對兩種酵母品系中存在的遺傳差異，進行高通量分析對酵母適應性(存活和增殖)的影響。
首先，為了提高HDR的效率，作者開發了“CRISPEY” (cas9-retron precise parallel editing with homology)技術。過去的研究發現，HDR效率最高的模板是單鏈DNA, 並且如果單鏈DNA處於Cas9誘導的DNA斷裂附近，可以提高HDR的效率。作者很巧妙的利用了細菌中存在的Retron系統（反轉錄酶操縱子，可以產生多拷貝單鏈DNA，然後與模板RNA共價連接）【1】，通過細胞內逆轉錄方式直接在細胞核內產生單鏈DNA, 並且和sgRNA共價連接。在酵母細胞中，與Cas9蛋白以及逆轉錄酶共表達後， sgRNA和HDR的修復模板 (逆轉錄後的單鏈DNA)可以同時被Cas9招募到DNA切割的位點，作者發現，這一方法可以誘導>80%以上的精確編輯，更重要的是，Cas9切割造成的Indel很少，提示這一系統中，HDR是主要的DNA雙鏈斷裂修復模式。進一步實驗表明這一系統可以精確的插入~700bp的DNA序列。
而後，通過這一體系，作者系統分析了在兩種酵母品系中有差異的SNP和small indels, 並且比較了誘導的突變對酵母細胞適應性的影響。在針對 16000個突變進行篩選後，發現很多影響酵母適應性的突變處於非編碼區，尤其是promoter區域接近轉錄因子結合位點的地方 。而在編碼區的錯義突變對酵母的影響反而影響較小。作者猜測主要原因在自然選擇後，不同酵母品系中毒性大的錯義突變數量較低。
如上所述，這篇文章開發了高效誘導HDR的方法，並且證明可以高通量的在酵母中進行遺傳分析。因為Retron過去發現在哺乳動物細胞內也有效，作者猜測類似系統也可以在其他物種中成功，但因為DNA損傷修復以及HDR機制的差異，這一策略在哺乳動物細胞中的應用可能還需要進一步探索。
注：本文解讀專家常興博士現為中國科學院上海營養與健康研究院研究員，青年千人。常興課題組主要開發了系列基因編輯工具用於探索調控免疫細胞分化的分子機制, 為疾病治療提供新靶點和新策略。
參考文獻：
1、Hsu, M. Y., Inouye, M., & Inouye, S. (1990). Retron for the 67-base multicopy single-stranded DNA from Escherichia coli: a potential transposable element encoding both reverse transcriptase and Dam methylase functions. Proceedings of the National Academy of Sciences, 87(23), 9454-9458.
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