最受關注的基因編輯技術是什麼？CRISPR！其中走得最快的系統是哪個？CRISPR/Cas9！
近幾年來，科學家不斷對CRISPR/Cas9系統進行改造，更敏感的檢測方法、更高效的Cas9酶、更好的遞送方式……與臨床之間的天塹鴻溝——脫靶效應，在研究者的努力下已經變得不那麼可怕，使用CRISPR/Cas9進行的第一批臨床試驗也提上了日程。
稍等，CRISPR/Cas9真的如我們所想的那樣安全嗎？繼上個月的致癌疑雲之後，本週《自然生物技術》又曝新問題，由CRISPR/Cas9介導的DNA雙鏈斷裂修復，極有可能造成切割位點遠端DNA大片段丟失、乃至其他更為複雜的基因突變[1]！
這種負面影響，一是丟失片段很長，可高達數千bp，可能影響細胞功能；一是距離切割位點較遠，可以位於20kb之外，正常評估流程難以檢測；一是隨機性強，每個樣本編輯後的基因型都有所不同，潛在影響的多樣化巨大！
該項研究來自英國惠康桑格研究所，人類基因組計劃中貢獻最大的科研機構。文章通訊作者則是著名遺傳學家Allan Bradley教授，他致力於癌症與基因的研究，他擔任研究所長期間重新調整了惠康桑格研究所的發展方向，研究所名下的十數個生物信息學數據庫少不了他的功勞。[2]
Allan Bradley
一般來說，科學家認為Cas9導致的DNA修復不會造成20bp以上基因的插入和缺失[3-5]，不過實際上確實有研究曾發現，單gRNA誘導能夠在小鼠受精卵中造成600bp以上的基因缺失[6]，同時，雙gRNA誘導也表現出了比預期更加複雜的基因型改變[7]。
而且，在大多數研究中，對基因編輯結果的分析，往往只關注靶點和潛在脫靶位點周圍很小一段區域（<1kb），這樣很可能會錯過一些並不連續的突變位點。再者，研究所使用的細胞往往來自癌細胞系，其基因組和DNA修復機制本來就不正常，結果是否能夠推廣到正常組織和細胞上也是個未知數。
Bradley教授和同事們認為，可能有大量的編輯錯誤我們並沒有發現，如果這些異常基因位於正在活躍增殖的細胞中，那麼很有可能會導致其他疾病。
為了搞清楚這個問題，研究者嘗試用CRISPR/Cas9系統編輯雄性小鼠胚胎幹細胞中的PigA基因。這個基因位於X染色體上，所以在XY細胞中沒有等位基因。
研究者首先嚐試了靶向基因外顯子的單gRNA，編輯效率還是很高的，59-97%的細胞PigA基因都喪失了功能。
然而奇怪的是，靶向內含子的單gRNA也能夠導致PigA基因失活。要知道這些靶點距離外顯子還挺遠，263-520bp之間的10個不同靶點編輯效率有8-20%，還有兩個靶點距離外顯子2kb開外，居然也能導致5-7%的PigA失活！
為了搞清楚這過程中發生了什麼，研究者對PigA缺陷細胞進行了大規模測序，結果發現靶向內含子的編輯，居然也會造成外顯子的缺失！也就是說CRISPR會造成意料之外的遠端DNA缺失！
靶向內含子也造成了外顯子缺失
研究者又繼續分離這些細胞挨個分析，發現將近四分之三的細胞（69/93）在切割位點和外顯子部分存在基因缺失，大小各不相同，最大能達到9.5kb；剩下的細胞則同時還有大片段插入等複雜的問題。
值得注意的是，這些“病變”與目標靶點並不相鄰，如果用通常的檢測方法，是根本無法發現的。
研究者還嘗試了從兩端同時擴增來自部分缺陷細胞的PigA基因，結果只能得到兩端的序列，得不到中間部分。進一步分析也顯示，存在著基因易位、倒錯這樣更為嚴重的結構變異。
此外，細胞與細胞之間的基因缺失狀況又各有不同，這意味著潛在的致病模式多得無法想象。
會造成各種嚴重的突變
鑑於實驗中PigA是單等位基因，考慮到可能具有特殊性，研究者又選取了另一種基因Cd9，這種基因位於常染色體上，並不是胚胎幹細胞生存必須的基因，它的表達產物也很容易被染色檢測。
重複以上實驗，結果顯示靶向外顯子的gRNA編輯效率達到88%，而靶向內含子的編輯效率則在2.6-3.8%之間。考慮到破壞兩個等位基因才能夠阻止Cd9表達，這個結果實際上和PigA得到的基本一致。
測序結果也顯示，Cd9基因中存在大片段缺失，最長達到5.5kb，而且27個Cd9缺陷細胞中，只有一個具有完整的外顯子。
那麼是不是由於小鼠胚胎幹細胞尚未分化，具有某些特性，所以才造成這些問題的呢？同樣的實驗又在永生化人女性視網膜色素上皮細胞系（RPE1）和小鼠造血祖細胞中進行，結果也很相似。
轉染方式也並非關鍵，無論是PB轉座子系統，還是電穿孔和脂質體轉染，CRISPR/Cas9造成的這種大片段缺失都是存在的。
人源細胞中突變情況也是類似的
本項研究中使用了小鼠的胚胎幹細胞、造血祖細胞和人成熟分化細胞，前兩者具有正常的DNA修復機制，而這三者都在臨床研究中有著應用。
考慮到臨床，事情就更加嚴肅了。臨床中往往要一次性編輯數十億個細胞，產生的大量不同突變很可能是致病的病變，乃至救命的細胞變成的致命的腫瘤。
Bradley教授表示，使用CRISPR/Cas9系統的風險“被嚴重低估了”，而本項研究“應當成為一記警鐘。”
這篇論文剛剛發表二十分鐘，業界領頭的CRISPR先驅們股價大跌，CRISPR Therapeutics股價下跌8.6%，Editas Medicine下跌7%，Intellia Therapeutics下跌近10%。超過3億美元市值憑空蒸發。[8]
不過這些新貴們倒並不慌張，畢竟如果基因編輯真的會造成如此嚴重的後果，那麼在鋅指或TALENs技術中也應當有體現——很顯然，並沒有人觀察到。
Intellia表示，他們一直在對小鼠編輯後基因組進行分析，目前為止還沒有發現任何“致癌”的突變。其副總裁Tom Barnes表示，這可能是由於Bradley團隊採用了積極增殖的細胞，而Intellia使用的細胞更為“靜止”[9]。
Editas則發佈聲明表示，公司致力於基於CRISPR的藥物，並不會受到這項研究的影響。
現在的問題和我們上個月討論的很類似了，如果這個現象是真的，那麼我們為什麼在此前的臨床前實驗中從未觀察到小鼠大規模爆發腫瘤呢？
至少目前可以確定，體外編輯細胞之後，做個全基因組測序恐怕很有必要。
問題頻出，或許說明正在步入正軌。
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[1]https://www.nature.com/articles/nbt.4192#ref-link-section-25 [2]https://www.sanger.ac.uk/people/directory/bradley-allan
[3] Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E.-P. & Velasco-Herrera, M.D.C. & Yusa, K. Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library. Nat. Biotechnol. 32, 267–273 (2014).
[4]van Overbeek, M. et al. DNA repair profling reveals nonrandom outcomes at Cas9-mediated breaks. Mol. Cell 63, 633–646 (2016).
[5]Tan, E.P., Li, Y., Velasco-Herrera, M.D.C., Yusa, K. & Bradley, A. Off-target assessment of CRISPR-Cas9 guiding RNAs in human iPS and mouse ES cells.Genesis 53, 225–236 (2015).
[6] Shin, H.Y. et al. CRISPR/Cas9 targeting events cause complex deletions and insertions at 17 sites in the mouse genome. Nat. Commun. 8, 15464 (2017).
[7] Kraft, K. et al. Deletions, inversions, duplications: engineering of structural variants using CRISPR/Cas in mice. Cell Rep. 10, 833–839 (2015).
[8]https://www.statnews.com/2018/07/16/crispr-potential-dna-damage-underestimated/
[9]https://www.nature.com/articles/d41586-018-05736-3?utm_source=fbk_nnc&utm_medium=social&utm_campaign=naturenews&sf193763122=1
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本文作者 | 代絲雨
“桑格研究所這個玻璃是真的好看。”
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