作者：1.劉利東 2.馬梓欣 3.林琪英 4.周承志
單位：廣州醫科大學附屬第一醫院1.檢驗科 ，2. 輸血科 ，4. 廣州呼吸健康研究院、呼吸疾病國家重點實驗室、國家呼吸系統疾病臨床醫學研究中心；3. 廣州醫科大學金域檢驗學院
膽紅素是體內鐵卟啉類化合物的降解產物， 主要來源於衰老紅細胞。血清膽紅素作為肝膽及血液系統疾病的診斷和治療指標在臨床應用廣泛，並一直認為其濃度升高對人體有害，事實上膽紅素具有強還原性，在首次被確認為內源性抗氧化劑後，它的抗氧化功能越來越受到重視。膽紅素在多種疾病發病過程中起重要作用，其中包括惡性腫瘤，但並不具有特異性。肺癌的發生受多種因素影響，肺癌組織存在氧化/抗氧化失衡，這種失衡可能與肺癌的發生和發展有關。有研究表明在正常範圍內較高的膽紅素可以降低肺癌的發病率，提示膽紅素可能對肺癌的發生有一定的抑制作用。為探明膽紅素是否通過抗氧化作用對肺癌的發生造成影響，本文將通過測定血清膽紅素 、超 氧化物歧化 酶（SOD）活性和自由基作用於脂質的終產物丙二醛（MDA）含量，分析它們之間的相關性，瞭解肺癌患者體內存在的氧化應激狀態及膽紅素在其中的作用。
1.材料與方法
1.1 標本來源
1.1.1肺癌患者組
2013 年1 月至2014 年11 月在廣州醫科大學第一附屬醫院確診為肺癌患者為病例組。入選本次研究病例標準為：（1）原發性肺癌，經細胞學或組織病理學確診，符合美國胸科醫師學會（ACCP）肺癌診治標準；（2）經病理免疫組化及腹部B 超、CT 或MR 等檢查排除肝膽系統疾病及其他腫瘤；（3）既往無其他腫瘤病史；（4）未進行化療、放療及手術切除等治療。最終入選 402 例，其中男234 例，女 168 例，年齡 27～86 歲，平均（60.09 ±9.9）歲。按美國聯合癌症分類委員會（AJCC）和國際癌症研究協會（IASLC）2009 年制定的TNM 分期標準（第7 版）進行分期，其中 T1 72 例，T2 147 例，T3 95例，T4 88 例。
1.1.2 對照組
隨機抽取同時期廣州醫科大學第一附屬醫院體檢中心體檢人群，排除心、腦、肝、膽、腎、內分泌疾病及腫瘤等疾病，最終入選 422 例，其中男 199 例，女 220 例，年齡 22～80 歲，平均（47.15 ± 10.97）歲。
1.2 儀器與試劑
膽紅素檢測儀器為 Beckman Coulter AU5821 全自動生化分析儀及配套試劑、標準品及質控品；SOD 和 MDA 測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，分別採用黃嘌呤氧化酶法（羥胺法）和硫代巴比妥酸法（TBA 法）。
1.3 標本採集和處理
1.3.1 對照者於清晨空腹採取靜脈血 3 mL，患者於入院後次日清晨空腹採取靜脈血 3 mL，選用含分離膠負壓採血管採血。室溫，3 300 r/min 離心 4min，總膽紅素及結合膽紅素的檢測為離心後立刻檢測，SOD 及MDA 則取血清置於⁃40 ℃冰箱保存， 並在3 個月內檢測。
1.3.2 總膽紅素及結合膽紅素含量的檢測儀器為Beckman Coulter AU5821 全自動生化分析儀，試劑為Beckman Coulter 配套重氮法檢測膽紅素試劑盒；104 例肺癌患者（其中 T1⁃T4 分期分別有 16 例、35 例、31 例和22 例）和57 例健康對照者檢測SOD 活性與MDA 含量的檢測，操作按試劑說明書進行手工操作，吸光度用752 紫外光柵分光光度計進行測定。
1.4 統計學方法
所有實驗數據採用SPSS 19.0 軟件進行統計分析，計量數據用均值 ± 標準差表示，組間均值比較採用獨立樣本的 t 檢驗，相關性分析應用配對樣本的 t 檢驗，當 P < 0.05 時為組間差異具有顯著性。
2.結果
2.1 對照組與肺癌組膽紅素、SOD 和 MDA 的測定結果
肺癌組結果與對照組進行比較，總膽紅素、結合膽紅素及未結合膽紅素和 SOD 均有明顯的下降（P < 0.05），而 MDA 則顯著性升高（P <0.05）（表 1）。這一結果提示，肺癌患者體內膽紅素和SOD 水平降低，可能導致患者體內抗氧化能力不足的原因，使細胞更容易遭到體內產生的氧化物質的破壞，促進細胞癌變。
2.2 對照組與不同肺癌分期的測定結果
為進一步研究膽紅素是否與肺癌的發展有關，本研究組按肺癌 TNM 分期標準將肺癌患者分為T1、T2、T3 及T4 四組，比較對照組與不同分期肺癌患者差異。對照組總膽紅素、結合膽紅素、未結合膽紅素、SOD 和 MDA 與肺癌T1～T4 組進行比較，結果顯示總膽紅素和未結合膽紅素T1～T2 期與對照組差異無顯著性，與 T3～T4 組則差異有統計學意義（P < 0.05），而結合膽紅素與 T2～T4 組差異有顯著性（表 2）。對照組 SOD 和 MDA 與T1～T4 組均差異有統計學意義（P < 0.05）（表 3）。雖然T1～T4 各組間所有檢測項目有一定的變化趨勢， 但統計學分析相鄰組間差異並沒有顯著性（P >0.05，數據未顯示）。提示膽紅素可能是在肺癌的發展中起作用，而在早期肺癌發生時變化並不明顯。
2.3 膽紅素與性別關係
有研究認為膽紅素與性別有關，為了解性別差異對膽紅素的影響，我們將對照組男女之間及肺癌組男女之間的膽紅素進行比較，發現對照組女性膽紅素比男性低，差異有統計學意義；但肺癌組男女之間差異無統計學意義（表 4）。筆者也分析了所檢測項目在不同肺癌 TNM 分組中男女之間差異，結果顯示並無統計學意義（P > 0.05，數據未顯示）。這說明健康男性膽紅素比女性高，這一結果與前期研究一致。但對於肺癌患者來說，正常的膽紅素抗氧化平衡被破壞，膽紅素水平處於較低水平。
2.4膽紅素與 SOD 及 MDA 的相關性分析
SOD是細胞內主要的抗氧化系統，而 MDA 是脂質氧化的產物。通過對膽紅素與SOD 和 MDA 的相關性分析，除在對照組中總膽紅素和未結合膽紅素與SOD 有低正相關（r 分別為 0.377 和 0.395，P <0.05），其餘的均無顯著相關性。具體相關係數見表 5。這一結果可能是因為膽紅素的抗氧化功能與SOD 不一樣，膽紅素獨立發揮抗氧化功能。
3.討論
腫瘤細胞過氧化物酶體的過氧化氫酶數量的減少及活性的減弱直接影響了氧化劑的清除，同時也使自由基的生成增加。有研究表明，血清SOD 活性測定對判斷腫瘤分期及預後具有一定意義，亦是檢測腫瘤標誌物之一。本研究結果顯示， 與對照組相比，肺癌患者的 SOD 活性降低，而MDA 含量升高，對照組與 TNM 分期T1～T4 分期肺癌患者SOD 活性和 MDA 含量差異均有顯著性， 但各分期間無顯著性的變化趨勢。表明肺癌患者存在著氧化/抗氧化失衡，肺癌腫瘤發生與抗氧化能力的下降有關 ，這 與國內前期研究數據一致。
較早前有研究認為與白蛋白結合的膽紅素（未結合膽紅素）具有較強的氧自由基清除能力，近期研究也認為未結合膽紅素可以抑制鼻咽癌在肺組織中的轉移，提高鼻咽癌的無轉移生存率 ，但 它的生物學作用機制並不十分明確。膽紅素的抗氧化活性主要在於能清除體內的自由基，膽紅素經血紅素加氧酶作用後轉變為膽綠素，再經還原酶的作用，轉變為未結合膽紅素，在此還原過程中可提供二個氫原子，起到抗氧化作用。膽紅素在正常人體內濃度約為 3.4～17.1 μmol/L，比已知的抗氧化劑谷胱甘肽的組織濃度的 0.1%還少，它強大的抗氧化作用是通過膽綠素還原酶的接觸性擴增作用實現的，佔機體總抗氧化能力的 30%左右。健康人膽紅素水平並不很高，可能是因為膽紅素作為強抗氧化劑在體內很快被消耗。雖然有關肺癌發生發展與氧化抗氧化的相關性分析研究報道很多，但有關血清膽紅素在肺癌的病理過程中的作用研究報道較少。HORSFALL 等通過統計英國綜合醫療研究數據庫中1988-2008 年記錄的504 206 名成人的血清總膽紅素數據發現血液中膽紅素濃度處於正常但卻相對較高範圍內的人，其肺癌、慢性阻塞性肺疾病及全因死亡風險會有所下降，其中膽紅素濃度增加 0.1 mg/dL，男性中的肺癌發病率會減少8% ，而女性中的肺癌發病率會降低 11%。WEN 等的研究也提示在男性吸菸者中，低水平的血清膽紅素與高肺癌發生率有相關。筆者對比肺癌患者與健康對照，無論是總膽紅素，還是未結合或結合膽紅素均有明顯下降，兩組差異具有顯著性。肺癌的發展過程與細胞內的氧化/抗氧化失衡加重有關，本研究中 T1～T4 分期的肺癌患者膽紅素與SOD 一樣，呈現下降趨勢，提示膽紅素含量的變化可預測腫瘤的發生與進展。機體大量的SOD、膽紅素等抗氧化劑在腫瘤組織集中，以清除腫瘤組織產生的氧化物質，隨著腫瘤的惡性增強， 機體氧化損傷加劇，脂質過氧化反應終極產物增加，抗氧化劑不足以拮抗氧化產物，從而表現為抗氧化劑活性或含量在肺癌中後期較早期下降。
本研究中，在TNM 各分期比較中總膽紅素、未結合膽紅素呈現逐漸下降的趨勢，而結合膽紅素未出現此趨勢，可能是結合膽紅素性質上水溶性強，不易通過生物膜，難與胞內氧自由基作用。另外，它作為白蛋白配基雖然也在血漿中轉運，但其結合不如未結合膽紅素緊密，抗氧化性相對較弱。筆者認為膽紅素在肺癌患者中的抗氧化作用主要由未結合膽紅素作用實現。雖然膽紅素有抗氧化作用，在肺癌發生過程中可清除逐漸增高的自由基，但研究認為膽紅素對白細胞的抗氧化作用時發現在生理條件下高濃度的膽紅素才具有抗氧化作用。本研究中，肺癌T1 和T2 分期的膽紅素濃度較T3 和T4 組的高，但無統計學差異（數據未顯示），這可能與標本量有關。
有研究認為膽紅素與性別相關，男性的外周血循環膽紅素比女性高，而隨年齡的增長膽紅素呈現下降趨勢。本研究結果發現，在正常對照組膽紅素男性比女性高，與前期研究相符，但肺癌組則兩者間差異無顯著性，可能是因為癌變發生後，體內的膽紅素抗氧化體系被打亂，不能執行正常的功能，均呈現低膽紅素水平。
本研究的初步結果顯示，正常範圍內的膽紅素含量與肺癌有一定的相關性，濃度變化與肺癌的進展也相關，高濃度的膽紅素可能是通過細胞內抗氧化機制降低肺癌發生的風險。研究表明，對於手術切除非小細胞性肺癌患者，術前膽紅素適當升高可以提高總體生存率、無疾病生存率和無轉移生存率，同時，結合膽紅素可以作為一個對非小細胞性肺癌的手術預後的指標。因本研究是對肺癌患者的小樣本調查，其結果可能會受到樣本量的影響，還需增加更大的樣本量，從而收集得到的數據分析可能會更有說服力。可以建立多中心合作的患者數據庫，可以通過大量樣本的研究，建立這一疾病的相關模型，當膽紅素水平出現有意義的變化時，可提示疾病的發生幾率，早發現早治療，從而提高疾病的痊癒率及治療後的生活質量。
文章節選自：實用醫學雜誌 2018 年第34 卷第10 期
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