近日，中國科學院南海海洋研究所熱帶海洋生物資源與生態重點實驗室的研究人員揭示了非典型角環素類海洋天然產物二聚體形成的關鍵機制。2018年5月25日，該研究成果以“Molecular basis of dimer formation during the biosynthesis of benzofluorene-containing atypical angucyclines”為題發表於Nature Communications（DOI: 10.1038/s4146704487-z）。
含有苯並芴（benzofluorene）結構的非典型角環素類化合物在自然界中分佈廣泛，骨架類型豐富多樣，生物活性優良，是開發抗腫瘤藥物和酶抑制劑的熱點分子，包括fluostatins（FSTs）及lomaiviticins等代表性化合物（圖1A），受到國內外生物學家、藥物化學家及藥理學家的廣泛關注。海洋微生物生產的具有獨特C2對稱結構的同源二聚體lomaiviticin A和具有C1？C5′非對稱結構的異源二聚體difluostatin A具有強烈的抗腫瘤和抗菌活性。其中，lomaiviticin A是極強的DNA損傷劑，能夠通過破壞DNA的方式殺滅癌細胞，目前正作為低劑量化療藥物進行臨床前評估。據報道，二聚化能顯著增強這些化合物的生物活性。因此，研究二聚化機制，對於非典型角環素類化合物的結構多樣化及構效關係研究至關重要。已有的研究表明，天然產物二聚體一般可由細胞色素P450氧化酶催化形成。但大多數情況下，二聚體形成機制仍是未解之謎。
前期工作中，研究人員從南海北部冷泉區沉積環境來源的稀有放線菌Micromonospora rosaria SCSIO N160的培養物中分離鑑定了非典型角環素類化合物FSTs（Journal of Natural Products, 2012, 75, 1937-1943；Organic Letters, 2017, 19, 592–595）；克隆了完整的FST生物合成基因簇（fls），在天藍色鏈黴菌Streptomyces coelicolor YF11中成功異源表達，獲得了結構獨特的二聚體化合物difluostatin A（Organic Letters, 2015, 17, 5324-5327，）。研究人員將fls生物合成基因簇在白色鏈黴菌Streptomyces albus J1074中進行了異源表達，又獲得一系列結構新穎的C？C或C？N偶聯的FST二聚體（difluostatins B–D）甚至三聚體trifluostatin A（圖1B）。
圖1. 代表性非典型角環素類化合物（A）和fluostatin生物合成基因簇及其在S. albus J1074中異源表達的代表性產物（B）。
非典型角環素家族中，這些結構複雜的C？C或C？N偶聯的二聚或三聚FSTs到底是如何形成的？據文獻報道推測，該類二聚體可能是由NmrA家族調控蛋白酶FlsQ1催化形成。研究人員隨後構建了flsQ1缺失突變株，但發現該突變株仍能生產difluostatin A。意外的是，研究人員經過反覆多次觀測發現，含有酰基的FSTs（acyl FSTs）可以在水溶液中經非酶催化的脫酰基反應自發形成C？C偶聯的FST二聚體，如difluostatin F （圖2A）。進一步深入研究發現：（1）acyl FSTs在非質子有機溶劑（如二甲基亞碸、丙酮和氯仿等）中表現穩定；（2）acyl FSTs在酸性條件下也表現穩定，但在鹼性條件下很容易脫酰形成二聚體；（3）acyl FSTs在H218O中所形成的脫酰基產物和二聚體產物都標記上了18O。據此，研究人員推測了acyl FSTs自發脫酰和二聚化的兩步反應機制（圖2A）：第一步反應是acyl FSTs通過非酶催化脫酰氧基形成一個對醌酮甲基化物（para-quinone methide, p-QM）中間體；第二步反應是該p-QM中間體通過和水進行1,6-親核加成反應形成“脫酰基”產物，或者通過與另一分子的FST進行親核加成反應形成結構多樣化的C？C或C？N偶聯的同源或異源FSTs類二聚體。
圖2. FlsH酶催化脫酰機理和非酶催化脫酰-二聚體形成機制（A）及其在合成C？C或C？N偶聯的FST二聚體中的應用（B）
為了證明該二聚體形成機制的合理性，研究人員通過化學半合成法，在水溶液中共培養acyl FST和prefluostatin，高效獲得了difluostatin A（圖2B）。進而，研究人員利用acyl FSTs能夠形成p-QM中間體的這種不同尋常的特性，通過化學半合成法製備了多種C？C或C？N偶聯的芳香聚酮二聚體（圖2B）。有意思的是，研究人員還發現水解酶FlsH能夠有效地催化acyl FSTs的脫酰反應（圖2A）。與自發脫酰相比，FlsH催化的脫酰反應速率提高了近230倍。經推測，FST生物合成途徑中進化出脫酰酶FlsH，可能是為了阻止acyl FSTs在體內的高濃度積累，以防其自發轉化為具有體內細胞毒性的p-QM中間體。
以上研究結果啟示，許多從自然界中獲得二聚體化合物或是由非酶催化形成的“非天然”產物。此外，該研究工作也暗示需要重新思考一下關於lomaiviticin A的二聚體形成的假設：酶催化的C–C偶聯反應還是非酶催化的自發反應？揭開這些複雜反應的神秘面紗，對於高效生產lomaiviticin A及創制新型非典型角環素二聚體類藥物先導化合物具有重大意義。
中國科學院南海海洋研究所黃春帥博士研究生和楊春芳助理研究員為該論文的共同第一作者，張長生研究員和美國德克薩斯大學奧斯汀分校的Hung-wen Liu教授為論文的共同通訊作者。研究工作獲得了中國科學院、國家自然科學基金、廣東省科技計劃等項目的資助。論文作者之一Bidhan Chandra De博士生是CAS-TWAS院長獎學金獲得者。
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1. Huang C,# Yang C,# Zhang W, Zhang L, De BC, Zhu Y, Jiang X, Fang C, Zhang Q, Yuan CS, Liu Hw*, and Zhang C*. Molecular basis of dimer formation during the biosynthesis of benzofluorene-containing atypical angucyclines. Nature Communications, 2018, 4487. DOI: 10.1038/s4146704487-z.
2. Zhang W#, Yang C#, Huang C, Zhang L, Zhang H, Zhang Q, Zhu Y, Zhang C*. Pyrazolofluostatins A-C, pyrazole-fused benzo[a]fluorenes from South China Sea-derived Micromonospora rosaria SCSIO N160. Organic Letters, 2017, 19 (3): 592–595. DOI: 10.1021/acs.orglett.6b03745. ("Hot off the press" in Natural Product Reports, 2017, 34 (4) : 338-342).
3. Yang C, Huang C, Zhang W*, Zhu Y, Zhang C*. Heterologous expression of fluostatin gene cluster leads to a bioactive heterodimer. Organic Letters, 2015, 17(21): 5324-5327. DOI: 10.1021/acs.orglett.5b02683r. ("Hot off the press" in Natural Product Reports, 2016,33(2): 122-126).
4. Zhang W#, Liu Z#, Li S, Lu Y, Chen Y, Zhang H, Zhang G, Zhu Y, Zhang G, Zhang W, Liu J, Zhang C*. Fluostatins I–K from the South China Sea-Derived Micromonospora rosaria SCSIO N160. Journal of Natural Products, 2012, 75(11): 1937–1943. DOI: 10.1021/np300505y.
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