早期住院和抗生素治療對嬰兒腸道菌群和耐藥性影響的宏基因組特徵

原創 莫沉 微生態 2019-11-07

導讀

住院的部分早產兒由於易受感染，需要長時間接觸抗生素。目前尚不清楚抗生素對早產兒腸道菌群和耐藥性的短期影響是否會在新生兒重症監護病房出院後持續存在。在本研究中，研究者利用宏基因組學、基於培養和機器學習技術來研究住院期間和住院後暴露於抗生素環境下的早產兒的腸道菌群和耐藥性，並將這些數據與同期採樣的未接觸抗生素的健康嬰兒進行比較。研究者發現在接受早期抗生素治療的早產兒中，其胃腸道中抗生素耐藥性持續增強，並且長期攜帶多藥耐藥腸桿菌以及具有獨特的抗生素驅動的腸道微生物群體和耐藥性組裝模式，表明接受早期抗生素治療和住院對早產兒的附帶損害是長期的。基於此，研究者在本文中敦促相關機構來共同制定有效的防控策略以減少對生理上極其脆弱的新生兒群體造成的上述不良影響。

論文ID

原名：

譯名：早期住院治療和抗生素治療對嬰兒腸道菌群和耐藥性影響的宏基因組特徵

期刊：Nature Microbiology

IF：14.3

發表時間：2019.10

通訊作者單位：華盛頓大學聖路易斯醫學院

實驗內容

1 抗生素對早產兒腸道菌群的影響

為了深入地瞭解，早產及相關的早期住院治療和抗生素治療對早產兒腸道菌群的長期影響，研究者對58名嬰兒在出生後21個月的437份糞便樣本進行了全宏基因組鳥槍測序分析。

研究者使用MetaPhlAn2推斷細菌的分類組成，在所有嬰兒中，Shannon多樣性在穩定之前的發育階段有所增加，同時在近足月嬰兒中，菌群的Shannon多樣性在平臺期前的第一個月內迅速增加，而早產兒菌群的多樣性增加得更緩慢且變化更大(圖1a)。在出生的頭幾個月裡，Enterobacteriaceae和Enterococcaceae在早產兒腸道中占主導地位。相比之下，在足月的嬰兒中Enterobacteriaceae的早期定殖先於Bifidobacteriaceae的強健定殖(圖1b)。與早產兒相比，Enterococcaceae在生命早期(<4個月時齡)在足月兒中明顯少於早產兒(P<0.001)，而早產兒的Prevotellaceae在嬰兒期後期(>8個月時齡)的丰度也同樣低於早產兒(P<1×10−10)。儘管存在上述差異，研究者還是發現瞭如HUMAnN2所推斷的，腸道菌群隨時間和組間的預測功能穩定性(圖1c)。此外，在校正多重比較後，研究者還發現生存天數與Shannon多樣性增加顯著相關(P<0.001)，而近期(樣本採集後30天內)使用萬古黴素(P<0.001)，氨苄青黴素(P<0.001)，美羅培南(P=0.009)或頭孢吡肟(P=0.012)則與多樣性降低顯著相關(圖1d)。在該隊列中，前一個月接受一個以上療程抗生素治療的嬰兒中，腸道菌群的Shannon多樣性顯著降低(圖1e)。因此，近期的抗生素治療似乎是生命早期決定菌群多樣性的關鍵驅動因素之一。

圖1 臨床變量預測微生物多樣性和組成.a.本研究中所有近足月(n = 17)和早產兒(n = 41)的Shannon多樣性；b.由MetaPhlAn2推斷的所有近足月(n = 17)和早產兒(n = 41)嬰兒的菌群種類和功能；c.由HUMAnN2推斷的所有近足月(n = 17)和早產兒(n = 41)的菌群種類和功能；d，生存期與菌群Shannon多樣性的增加顯著相關，而取樣前一個月內萬古黴素、氨苄西林、美羅培南或頭孢吡肟處理與物種豐富度顯著降低相關。以受試者為隨機效應的廣義線性混合模型。苯唑西林被包括在模型中，但在多重比較校正後並不顯著；e. Shannon多樣性在過去一個月中接受多於一個療程抗生素治療的嬰兒明顯低於在此期間未接受抗生素治療的嬰兒, 使用雙側Wilcoxon秩和檢驗進行統計分析，並進行Benjamini-Hochberg校正。

2 新生兒重症監護室出院後菌群可以得到部分恢復

儘管早產兒菌群的分類組成按出生時的胎齡和抗生素治療狀態有顯著聚集(Adonis test，P<0.001，Bray-Curtis Distance)，但是按時間順序的年齡是所有嬰兒菌群組成的主要驅動因素(圖2a)。為了量化這種擾動的程度，研究者使用隨機森林來分析嬰兒菌群中物種的相對丰度與他們的時間年齡的關係。準確預測所需的最小變量數為50(圖2b)。因此，研究者訓練了一個由50個關於足月嬰兒子集的最具信息的預測因子組成的模型，以模擬健康的菌群發育體系，並隨後對該模型進行了改進和驗證。

圖2 新生兒重症監護室出院後早產兒腸道菌群的部分結構恢復. a. 早期僅使用抗生素治療的早產兒和早期和隨後進行抗生素治療的早產兒之間的菌群組成是不同的(Bray-Curtis Distance；P 

3 早產兒腸道菌群的耐藥性

我們對具有耐藥性的宏基因組插入片段進行了測序，並組裝了874個特異基因。這些功能篩選的抗生素耐藥相關基因對NCBI非冗餘蛋白數據庫的識別中值為94.4%，而對綜合抗生素耐藥性數據庫(Comprehensive Antibiotic Resistance Database,CARD)條目的識別中值為32.0%(圖3a)。因此，儘管在我們的功能選擇中發現的大多數抗性決定因素已經被預先排序，但它們往往沒有被分配抗性功能。賦予開放閱讀框架(open reading frames, ORF)的預測抗藥性來源(由NCBI非冗餘蛋白數據庫中的最佳BLAST結果確定)主要是未培養的細菌或Enterobacteriaceae (圖3b)。在嬰兒腸道菌群中鑑定Enterobacteriaceae可能是生素耐藥相關基因的宿主，這與目前對Enterobacteriaceae是抗生素耐藥相關基因的多產宿主的理解是一致的。研究者使用ShortBRED擴展了其對於抗性組的分析，以量化所有測序的Metagenome中翻譯的抗生素耐藥相關基因的丰度，該數據庫包括來自CARD的所有抗生素耐藥相關基因以及這裡確定的功能選擇的抗生素耐藥相關基因。抵抗體根據出生時的胎齡和抗生素治療狀態聚類(圖3c；P<0.001，Adonis test)。

圖3 早產兒的腸道菌群有較強的耐藥性. a. 所有功能性篩選的耐藥基因及其在綜合耐藥數據庫中的最高匹配度與在NCBI非冗餘蛋白數據庫中的最高匹配度之間的氨基酸同源性，後者由用於選擇的抗生素的種類決定；b. 根據NCBI非冗餘蛋白質數據庫的最高識別點擊率，預測宿主功能選擇的耐藥基因；c. 腸道耐藥基因在早產兒、僅早期抗生素治療的早產兒和早期及隨後抗生素治療的早產兒之間存在差異；d.與近足月的嬰兒相比，早產兒腸道宏基因組中編碼的獨特耐藥基因較少；e. 早期和隨後進行抗生素治療的早產兒腸道微生物區系中的累積耐藥組相對丰度顯著高於僅接受早期抗生素治療的早產兒和近足月兒; f. 隨機的森林模型訓練了早產兒的腸道耐藥性，卻不能很好地預測出近期嬰兒的實際年齡; g. 50個最具信息性的抗性基因在足月兒和早產兒生命最初幾個月的相對丰度變化;

4 耐多藥Enterobacteriaceae在早產兒腸道中的持久性

研究者優化培養條件以分離機會性腸外病原體，已知這些病原體在嬰兒腸道中高度富集，以及那些經常發生多重耐藥的病原體。總共，研究者從這30個樣品中培養了530個分離株，分別對來自早產和足月組的277個和253個分離株進行全基因組測序、組裝和註釋。通過這種直接選擇最常分離的菌種依次是，E. coli (n=139)，K.pneumoniae(n=62)，E.faecalis (n=50)，Enterobactercloacae (n=42)，Enterococcusfaecium(n=22)，Citrobacterfreundii (n=15)和Klebsiellaoxytoca (n=14)。我們鑑定了從早產兒和早產兒採集的樣品中幾乎相同的E. coli, E. cloacae 以及K. variicola在嬰兒體內的持久性。這些高度相似的持續分離株對來自嬰兒，包括在住院期間和出院後收集的樣本中的分離株(圖4)。研究者從新生兒重症監護病房和出院後的早產兒腸道中分離出幾乎完全相同的多藥耐藥Enterobacteriaceae，其平均核苷酸識別度超過99.997%(圖4b,d,f)。這些數據支持與早產、早產住院和抗生素治療相關的持久和可傳播的病理性微生物群落。有趣的是，

圖4 多重耐藥Enterobacteriaceae lineages在嬰兒腸道菌群中持續存在. 從嬰兒糞便樣本中分離的E. coli(a)、Klebsiellaspp (c)和E. cloacae (e)的最大似然核心-基因組系統發育；E. coli (b),Klebsiella spp(d) 和E. cloacae (f) 的平均核苷酸同一性(ANI)熱圖，表明持久分離株是同源的-即它們具有超過99.997%的核苷酸同源性，持久隔離對以紅色突出顯示; g. 從嬰兒糞便標本中分離持久性Enterobacteriaceae細菌的時間線,豎線表示嬰兒出院的日期，顯示的前兩個嬰兒是早產兒，而第三個是足月兒.

5 抗生素治療所引起的腸道菌群持久性宏基因組特徵

為了進一步地瞭解早產兒、住院和抗生素治療是否對腸道菌群含量和功能產生持續地影響，研究者試圖找出相關宏基因組特徵，以區分早產兒在新生兒重症監護室出院後的樣本與年齡匹配的近期未使用抗生素的嬰兒的樣本。研究者使用有監督的學習方法，根據嬰兒腸道中細菌類群和抗生素耐藥相關基因的相對丰度，將樣本分類為來自住院早產兒(包括僅限早期和早期及隨後的抗生素治療組)或居住在家中的足月嬰兒。使用支持向量機算法，研究者識別了15個最具信息的特徵，並構建了僅由這些變量組成的模型，該模型正確地分類了所有的早產兒和17個短期樣本中的15個(96.4%的準確率；圖5a)。在對模型性能最重要的15個變量中，6個是抗生素耐藥相關基因，9個是細菌分類群

圖5 對早產兒的腸道菌群的持久損害. a. 支持向量機混淆矩陣基於從新生兒重症監護室出院後菌群中存在的菌種和耐藥基因對孕齡進行分類; b. 對分類最重要的15個預測因子, 僅使用這15個預測因子訓練的稀疏模型具有很高的精確度 (96.4%的分類準確率)，是早產和相關住院和抗生素治療的持久元基因組特徵；

結論

在本研究中，研究者通過將宏基因組測序、選擇性和差異糞便培養與分離測序、功能宏基因組學和機器學習相結合的方法，比較分析了早產兒早期使用抗生素治療和住院治療的糞便宏基因組特徵。儘管腸道菌群的成熟度明顯恢復，早期使用抗生素治療的腸道菌群特徵是具有豐富的腸道菌群耐藥性和腸道持續存在的Enterobacteriaceae。不管早產或抗生素暴露，儘管研究者使用了廣泛的功能分類法，所觀察到的腸道菌群的功能變化並不是很顯著。上述研究強調了整合基於測序和培養的方法來檢查腸道菌群的必要性，以揭示擾動的未被充分認識的影響。這些互補方法提供的數據支持在嬰兒腸道內菌群的動態群落結構中，早產兒住院治療和抗生素治療與早產相關的持久性的宏基因組特徵。值得注意的是，研究者暫時未能將抗生素的影響與其他與早產兒相一致的不良早期事件(如延長住院和疾病)的影響隔離開來。雖然目前在新生兒中探索這些變量的干預性研究是不可行的，但未來的基於模式動物的研究可以在一定程度上提供對上述變量的相對貢獻的重要參考。

評論

腸道微生物在宿主的一生中，特別是在嬰兒期，對宿主的健康和疾病的發生發展有著十分重要的作用。嬰兒腸道菌群(Infant gut microbiota, IGM)在其出生後的最初幾個月裡會加速組裝，在此之前，嬰兒會從母體和環境中接種微生物，但在大約三歲時就會穩定下來。在這段時間內用抗生素治療可能會不成比例地破壞宿主-菌群建立起來的生態系統。事實上，最新的研究表明，早期腸道微生物的變化與後來生活中的慢性代謝和免疫紊亂相關，包括過敏、牛皮癬、肥胖、糖尿病和炎症性腸病等。然而，對於大多數這些疾病來說，抗生素介導的菌群結構的破壞和病理發生之間缺乏必要的因果聯繫。對此，相關研究發現，嬰兒早期的抗生素治療與兒童期的永久性免疫改變和炎症性腸病有關，這一結果強調了早期抗生素治療對人體的長期破壞性潛力。

就目前而言，在全球範圍內，超過11%的嬰兒出現早產及其相關後遺症是導致兒童發病率和死亡率的主要原因。由於細菌感染是早產的常見併發症，美國新生兒重症監護病房(neonatal intensive care units, NICUs)中有將近79%的較低出生體重和87%的極低出生體重嬰兒，在出生後3天內接受了抗生素治療。即使是健康的嬰兒，其胃腸道也存在多種抗生素耐藥性，其形成受抗生素治療、飲食和環境等諸多因素的影響。

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