單位：清華大學附屬北京清華長庚醫院檢驗醫學科
2019年12月，由2019新型冠狀病毒（2019 Novel Coronavirus, 2019-nCoV）感染引發的病毒性肺炎（COVID-19）在湖北省武漢市迅速蔓延，並且呈全球性流行趨勢。疫情被世界衛生組織列為“國際關注的突發公共衛生事件”。2019-nCoV與2003年流行的SARS-CoV 和2012年流行的MERS-CoV均屬於β-冠狀病毒屬。目前，該病毒已被納入我國乙類傳染病，並按照甲類傳染病進行預防和控制【1】。流行病學數據顯示，2019-nCoV的傳播速度很快，但致病性要弱於SARS-CoV和MERS-CoV。但是，仍有10% -20%的患者病程發展迅速，其中部分患者進展為重症肺炎或發生急性呼吸窘迫綜合徵等臨床表現等【2】。2019-nCoV的病毒分離、分子及蛋白結構解析已在疫情初期完成。
2019-nCoV感染患者的常規臨檢與生化檢測包括：血常規、尿常規、C反應蛋白、凝血功能、血沉、肝腎功能、降鈣素原、肌酸激酶、肌紅蛋白、肌鈣蛋白等。有文獻報道，2019-nCoV感染引起的炎症因子風暴是導致病情迅速進展的重要因素【3-6】。臨床對確診患者應結合病情、病程，特別是重症或危重症患者有必要進行免疫學檢測：本文結合冠狀病毒感染引起的肺炎的致病特點，總結2019-nCoV感染的免疫學指標，為疾病的治療與預防提供參考。
一、冠狀病毒的病原學及2019-nCoV感染機制
冠狀病毒（Coronaviruses）在電子顯微鏡下呈日冕或皇冠狀【7】。全球第一例已知的冠狀病毒是1937年自病雞的體內分離出的禽傳染性支氣管炎病毒；第一例人冠狀病毒在1956年於人類鼻腔分離，但遺傳進化分析結果顯示，該病毒起源於蝙蝠，且與人類共存至少500-800年【8, 9】。根據冠狀病毒的血清學和基因組特點，將冠狀病毒亞科分為α、β、γ、δ四個屬，其中β屬又分為A、B、C、D系【10】。冠狀病毒主要編碼4種結構蛋白為棘突蛋白（S蛋白）、核衣殼蛋白（N蛋白）、膜蛋白（M蛋白）和包膜蛋白（E蛋白），這些蛋白是維持冠狀病毒結構完整性的必要蛋白【11】。其中S蛋白介導病毒附著於宿主細胞的表面受體，驅動病毒和宿主細胞膜之間發生融合，促進病毒侵入宿主細胞【12】；N蛋白是形成病毒中病毒樣顆粒（VLP）的必需蛋白【13】；M蛋白是最大的結構蛋白，常與其它結構蛋白相互作用，決定了病毒包膜的形狀【14】；E蛋白是最小的結構蛋白，在宿主細胞內大量表達，與病毒的重組、成熟及複製有關【15-17】。
作為冠狀病毒家族成員，2019-nCoV有包膜、呈直徑為60~140 nm的圓球形或橢圓球形。我國學者Xu 等對其進行了遺傳進化分析，發現2019-nCoV的分子核酸序列與SARS-CoV和MERS-CoV有明顯區別，2019-nCoV與SARS-CoV的分子序列同源性是70%；它與MERS-CoV的序列同源性是40%。隨後，該課題組通過對2019-nCoV 的S蛋白的結構模擬，發現其受體結構域與MERS-CoV病毒的受體結構差異很大，MERS-CoV的受體是二肽基肽酶-4（DPP-4），繼而排除了2019-nCoV的S蛋白受體是DPP-4的可能性。2019-nCoV的S蛋白整體結構與SARS-CoV病毒相似度極高，雖然其與人受體ACE2相互作用的蛋白與SARS-CoV病毒相比發生了4個氨基酸的改變，然而該突變並不影響其與ACE2受體蛋白相互作用的結構構象。上述證據支持2019-nCoV是通過S蛋白與受體蛋白ACE2相互作用，從而侵入人體呼吸道上皮細胞，且具有很強的感染人的能力【18】。
二、2019-nCoV感染的免疫學指標
1.淋巴細胞計數及淋巴細胞亞群分析：淋巴細胞減少是SARS和COVID-19發病早期的共同表現，也是病毒感染性疾病的非特異性表現。對COVID-19患者，淋巴細胞計數減少被認為是預後較差的一個檢驗學指標【11-13】，其主要影響的淋巴細胞種類是CD4+ T 淋巴細胞，但也包括CD8+ T淋巴細胞和自然殺傷細胞（NK）。這一表現與SARS-CoV感染極為相似，在重症與合併ARDS的SARS患者中，CD4+與CD8+T淋巴細胞計數均明顯降低，但CD4/CD8比值無明顯變化。通過淋巴細胞計數與淋巴細胞亞群分析，包括 T細胞（CD3+）、B細胞（CD19+）、NK細胞（CD16/CD56）、輔助性T細胞（CD3/CD4）和抑制性T細胞（CD3/CD8）的分析，可以瞭解患者的免疫功能狀態，對了解COVID-19發病機理、判斷預後和指導臨床治療均有意義。
細胞毒T淋巴細胞（cytotoxic T Lymphocyte，CTL）在機體抵抗各類病毒感染，以及因病毒感染所致的免疫病理損傷起到了極為重要的作用。我國學者的研究結果顯示：CD8+ CTL在急性SARS-CoV感染中參與控制病毒複製、以及導致免疫損傷中發揮雙重作用【19】。SARS-CoV感染肺部組織後，導致組織中的上皮細胞、肺細胞、基質細胞、抗原呈遞細胞等釋放細胞因子或趨化因子，吸引特異性CCR5+CD44+ CTL遷移至肺部。這些特異性淋巴細胞被招募到外周組織清除病毒的同時， 外周血中的CD8+就會明顯減少，這也是造成SARS-CoV感染相關的淋巴細胞減少症的原因之一【19】。目前CTL在COVID-19疾病控制和機體免疫的作用尚不明確。
2.細胞因子檢測： 細胞因子是由免疫細胞產生的、一類具有免疫調節和效應功能的蛋白質或小分子多肽。COVID-19的重症/危重症患者會出現IL-2、IL-6、IL-7、IL-10、GSCF、IP10、MCD1、M1D1A、以及TNF-α 等細胞因子不同程度的升高。有必要根據病程發展，適當檢測相應的細胞因子，旨在評估患者的自身免疫狀態、精準治【20】。病毒感染宿主後，通過宿主細胞進行復制、並在傳播過程中造成宿主細胞死亡，誘發炎症反應，炎症反應加速免疫相關細胞聚集和細胞因子釋放【21, 22】；另一方面，CTL還能破壞病毒感染的組織細胞，並誘導更多的中性粒細胞和巨噬細胞遷移至損傷的組織，而遷移來的致敏淋巴細胞和單核/巨噬細胞等會產生更多的炎性因子，導致細胞因子網絡失調，並且提高了吞噬細胞和NK細胞的殺傷活性，病情趨於惡化【19】。對細胞因子的檢測有助於治療評估，如對過強免疫因子釋放的患者有必要適量使用激素，有報道血液淨化治療有助於清除過量細胞因子，對重症患者治療有一定作用【1】。當前，臨床實驗室常用的細胞因子檢測包括IL-6、IL-2及TNF-α，隨著基礎研究開展，希望對其它細胞因子包括IFN-α/β/γ的研究不斷完善。
3. 2019-nCoV特異性抗體檢測：根據《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第六版）》，病毒核酸檢測陽性仍是COVID-19診斷依據。但臨床常遇到疑似患者多次2019-CoV核酸檢測假陰性的情況，這一現象加大臨床診斷的難度，也給疑似患者收容、治療帶來困難甚至延誤病情。核酸檢測假陰性的影響因素很多，檢驗前包括：樣本的採集、存放、轉運、RNA提取方法等多方面因素；檢驗中包括試劑質量、操作技術、質量控制等。新版《新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術指南》中已經提出用血清樣本進行抗體檢測作為輔助診斷的要求。
2019-nCoV抗體檢測試劑盒包括針對IgM、 IgG，以及IgM/ IgG聯合檢測三種類型。臨床評估實驗顯示抗-IgM和抗-IgG的臨床特異度分別為96.20%和94.41%；COVID-19確診病例中，抗-IgM敏感度為70.24%，抗-IgG的敏感度為96.1%。另外，在19例核酸檢測陰性的患者中，有16例患者的抗-IgM為陽性（84.21%），18例為抗-IgG陽性（94.74%）【23】。該結果顯示，2019-nCoV抗體檢測具有良好的敏感度和特異性。其應用可以部分彌補了核酸檢測“假陰性”漏洞，值得臨床推廣。同時應該看到，目前對試劑的應用均基於流行期間確診患者的小樣本分析，對於2019-nCoV後流行期的應用效果尚需大樣本檢測分析。
目前，我國獲批的2019-nCov抗IgM和IgG檢測試劑盒主要採用2019-nCov的包膜蛋白E和核衣殼蛋白N作為抗原。膠體金法檢測所需樣本量較少、操作簡便、樣本不需要離心處理，可以減少氣溶膠汙染的可能性；基於酶聯免疫與化學發光法檢測需靜脈採血及樣本離心等操作，增加了氣溶膠汙染的可能性，但是其準確度和靈敏性更優。此外，應該關注針對COVID-2019的抗體檢測，尤其是IgG抗體檢測，可能受到既往其它冠狀病毒感染的影響。文獻報道已治癒的SARS患者，通過體液免疫產生的IgG抗體，可以持續超過12月以上。其次，要注意IgM抗體檢測可能受到類風溼因子、自身抗體及異嗜性抗體干擾導致假陽性；第三，由於對IgG抗體檢測需要間隔一段時間追蹤複測，會造成臨床不便，因此，有必要設立國家標準品，用以對IgG抗體檢測進行相對定量。鑑於新冠病毒無既往感染，希望在近期推薦針對IgG的cut-off作為判斷感染的標準。
綜上，臨床診療中有必要結合臨床症狀、影像學特徵，以及免疫相關的指標， 動態監測病情變化，對重症病例做到早預警，及時干預，提高治癒率。
參考文獻略
注：本文來源於《臨床實驗室》2020年第3期“新冠病毒實驗室診斷”專刊
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