王莽末年，各地義軍蜂起，涼州豪強隗囂起兵反莽，叛亂者多有歸附，馬援也慕名投到他的名下。隗囂非常器重馬援，任命他為綏德將軍，與他共商如何對付已經稱帝的劉秀和公孫述。隗囂想聯合公孫述一起消滅光武帝劉秀，就派馬援前往蜀地觀察情況。
公孫述是馬援的老鄉，從前又頗有交情。馬援一到成都，直以為公孫述會喜逢故人，執手言歡，沒想到公孫述儼然以帝王自居，戒備森嚴，繁瑣的禮儀之後三叩九拜，過後一句話也沒說就把他安頓到賓館住下。第二天先讓文武肅立金殿，安放好貴賓席後，公孫述才鸞駕雕車，侍衛林立，逶迤曲折的進入金殿。公孫述想封馬援為大將軍，馬援的隨從人員都希望他留下，馬援開導他們說：“現在天下勝負未分，公孫述不是禮賢下士，共圖大事，反而刻意擺架子，與偶像有什麼差別？這樣的人怎麼能夠留得住人才？
他回到涼州後，隗囂問他公孫述是怎樣一個人，馬援說：“一隻坐井觀天的井底蛙，妄自尊大，成不了氣候。”
隗囂又派馬援送書信於洛陽，光武帝在宣德殿接見他，中黃門引進宮裡，光武帝趕忙站起相迎，笑道：“先生在兩位皇帝間來往悠閒，佩服佩服！我到今天才到見到先生，慚愧慚愧！”
馬援趕忙下拜，表示歉意：“當今之時，君王固然要挑選賢臣，臣子也要選擇明君。我跟公孫述是老鄉，從小一起玩兒的，前些日子去見他，他儀仗簇擁，神氣十足，然後請我相會，我來洛陽，陛下從未見過我，難道不怕我是刺客？如此隨隨便便，太沒意思了。”
光武帝笑著請他就座：“先生不是刺客，只怕是說客吧？”
馬援情不自禁地讚歎道：“天下大亂，到處有人稱王稱帝，今天看到陛下的氣概，簡直就像高祖再生，帝王到底是帝王！”
馬援在洛陽期間，劉秀與他開懷暢談數十次，兩人非常投機，都感到相見恨晚。
回到涼州，隗囂問他關於洛陽的情況。馬援說：“我到了朝廷，皇上引見數十次，每次宴飲談話，都是自傍晚到天亮。皇上才智睿明，勇敢有謀略，不是一般人能比得上的。而且開誠佈公，無所隱藏，豁達大度，風範差不多和漢高祖一樣。經學博覽，政事文辭，前世無比。”
隗囂說：“你認為與漢高祖比哪個更高明？”
馬援想了想說：“不如漢高祖。高祖與人相處，可無可不無；光武帝對治理官吏的事特別喜歡，一舉一動都講究要合節度，又不喜歡飲酒。”
隗囂聽了馬援的介紹，雖然心存疑慮，但迫於形勢，不得不派長子去洛陽做人質，表面上表示歸附劉秀，馬援也藉機把家屬帶到了洛陽。
馬援走後，野心不死的隗囂不顧馬援的規勸，公開打起了反漢的大旗。馬援知道隗囂對他頗為不滿，也知道對這種“自挾奸心鬥，盜憎主人”的渾人再勸也沒用，便上書光武帝，表示自己久存仰慕之情，願意臣服東漢。劉秀也十分賞識馬援，自從是上次相聚，就已有心引為己用。看了馬援的上書，立即召見，共議征討隗囂大計。光武帝按照馬援制定的作戰部署，一舉殲滅了西涼的這股最大的反對勢力。
因為馬援對西涼的民情地理非常熟悉，就任命他為隴西太守。馬援鎮守西域期間，安撫團結少數民族，興修水利，使那裡從前習慣於搶掠流浪的遊牧部落不在流徙，安居樂業，使西北部的經濟得到發展，疆域逐步穩定。
後來馬援以62歲高齡領兵南征，病死於軍中，實現了他“男兒要當死於邊野，以馬革裹屍還葬耳”的豪邁誓言。
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