TNF受体超家族的成员基于其重要的生理功能和精巧的调控机制，过去、现在和将来都是深度药物研发的热门靶点，4-1BB（CD137）也不例外。据小编统计，目前临床在研的靶向4-1BB的抗体类药物不下8个，均为激动剂。
进度最为领先、被人们分析得最为透彻的是辉瑞的utomilumab和BMS的urelumab。过往的临床试验结果难言令人满意：urelumab单药对实体瘤显示一定的响应，但具有明显的肝毒性，为了安全性调低剂量后，单药效果又不显著；utomilumab安全性更好，但效果不显著。因此，该靶点的药物开发值得从头开始调整策略。经过各个角度深入的分析，业界认为，影响4-1BB靶向性抗体的活性和毒副作用的关键因素有2个：
首先是FcγRIIB通过对抗体Fc的cross-linking促进4-1BB的聚集。过往多年的研究证明，FcγRIIB自身是一个具有负向调控作用的受体，抗体Fc段与FcγRIIB的强结合会增强FcγRIIB的负向信号，同时减少Fc段与激活型FcγR的结合，从而整体削弱Fc段介导的抗肿瘤作用。但近年来的研究发现，对于免疫激活型的抗体，FcγRIIB介导的抗体cross-linking在活化受体的寡聚进而激活其下游信号通路的过程中发挥了至关重要的作用；同时，这也是抗体毒副作用的重要来源（如图1）。
图1 FcγRIIB通过介导抗体的cross-linking激活免疫细胞上的靶点
人体肝窦内皮细胞表面有FcγRIIB的表达，Urelumab临床实验中大量出现的肝毒性很有可能是由于这些FcγRIIB引起抗体的cross-linking，从而导致T细胞在肝脏部位的大量浸润和活化。
其次是抗体的抗原结合表位对抗体功能的影响（这也包括对FcγRIIB的作用的直接影响）。从复合物晶体结构上看，urelumab结合在4-BB顶端的CRD1结构域（如图2b），是以接近垂直的角度相互接触，理论上给FcγRIIB介导的cross-linking作用留下了充分的空间；而utomilumab则是结合在CRD4区域（如图2a），靠近跨膜区，且与4-1BBL的结合区域有部分重叠，理论上不仅角度别扭，影响抗体Fc段的功能，而且干扰4-1BBL对4-1BB的天然激活。这些结构信息能够部分解释为何urelumab的激活相应明显强于utomilumab。
图2 urelumab和utomilumab在4-1BB上的结合位点
因此，4-1BB靶向性药物开发的核心问题是如何较为合适地激活4-1BB。针对urelumab的调整策略是降低剂量，并与其他药物联用；而utomilumab活性较低，必须尝试联用。其他在临床在研的抗体项目目前尚在一期，详细的临床数据尚未获得，但相信都做了一定改进。比如艾伯维公司就发表过文章，宣称他们筛选到了高抗肿瘤活性、低肝毒性的候选抗体分子。
而除了从单抗本身进行优化之外，人们也对药物进行着多样化的结构设计，比如罗氏的双特异性抗体-融合蛋白分子RG6076，其靶向4-1BB的结构域采用的是4-1BBL三聚体形式（此处顺便highlight一下三叶草的SCB-333），模拟天然配体对靶点的调控（如图3）。
图3 RG6076的结构示意图
这里，小编介绍Bicycle Therapeutics公司在4-1BB上的布局。从公开的资料可以看到，这家以环肽药物筛选为核心技术的公司，围绕该靶点正在开展3个项目的研发（如图4）。虽已不是新闻，但价值不容低估。
图4 Bicycle Therapeutics公司关于4-1BB的在研项目
BT7401针对4-1BB单个靶点，其余2个项目为双靶点分子的开发。3个项目均处在早期阶段。
BT7401
Bicycle的药物分子开发是从环肽库的筛选开始，BT7401项目也不例外。前期的分子筛选流程如图5A：他们先通过噬菌体淘洗初步获得能够与4-1BB蛋白结合的环肽分子，在此基础上做亲和力成熟并进一步筛选，得到的候选分子再做稳定性改造；在改造够的分子上挑选多个氨基酸位点，分别插入赖氨酸作为连接位点，同时使用不同长度的二价、三价和四价PEG连接子，构建二聚环肽。三聚环肽和四聚环肽，组合超过60个。这样的多聚环肽的设计，原理上是模仿天然配体对4-1BB的结合和调控（如图5B）
图5 BT7401的筛选流程
利用过表达4-1BB的NF-κB报告基因细胞系，他们对这些候选的多聚分子的4-1BB激活能力进行测试，得到各自的EC50和ECmax值（如图6）。
图6利用过表达4-1BB的NF-κB报告基因细胞系检测候选分子的活性
基于这2个数据，他们挑选最有潜力的分子进行后续的功能验证，包括T细胞激活效应和抗肿瘤活性的检测。
图7 候选分子的体细胞激活效果和体内抗肿瘤效果
BT7480（Nectin-4/CD137 TICAs）和EphA2/CD137 TICAs
与BT7401不同，BT7480和EphA2/CD137 TICAs都是双特异性bicycle分子，一个环结合4-1BB，另一个环结合癌细胞抗原，两个环之间用PEG连接（如图8）
图8 双特异性bicycle分子的结构和作用方式
基于这样的设计，对4-1BB的聚集和活化的促进是依靠癌细胞表面抗原的高表达丰度。从细胞共培养实验的结果也可以看出，癌细胞抗原的高表达能够促进环肽分子介导的4-1BB活化（如图9）
图9 通过细胞共培养实验检测癌细胞抗原的表达丰度对4-1BB的活化的影响
随后的小鼠模型实验也证明，这类双特异性bicycle分子能够促进体内T细胞的活化，并且能够明显抑制肿瘤的生长，且没有明显的肝毒性（如图10）
图10 双特异性环肽分子在肿瘤模型鼠体内的有效性和安全性
既然Fc段的功能如此难以理顺，索性就放弃Fc段。Bycicle的在研分子的机理，无论是分子本身促进4-1BB的寡聚，还是通过癌细胞表面抗原的聚集促进4-1BB的寡聚，均不涉及与FcγR的相互作用。4-1BB靶向性药物的开发和优化的历程，充分体现了抗体药物开发逐渐精细化的趋势。小编觉得，Bicycle的技术平台对于4-1BB激动剂的开发，是一个非常精巧的工具。不管后面的研发会进展如何，业界都需要这样的尝试，为药物研发的进步提供更多的想法和策略。
除了4-1BB之外，TNFR超家族的其他成员，如OX40、CD27等，生物学机理和药物开发的思路都有明显的共通之处。大家在单独开发各个靶点的过程中积累的知识和经验，会逐渐形成一套规范的逻辑和范式。相信，大举攻克TNFR超家族的成药性问题和优化药物开发的时刻已经到来。
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