Science子刊：麻省理工科學家發現「升級版」Cas9酶

CRISPR基因組編輯系統已成為醫學研究中非常重要的工具，並最終可能在農業、生物能源和糧食安全等領域產生重大影響。然而，儘管基因編輯工具取得了相當大的成功，但CRISPR-Cas9在基因組上的

CRISPR-Cas9系統需要Cas9酶在引導RNA（gRNA）的指引下負責切割特定的DNA序列。 其中，Cas9酶依賴於靶位點側翼的特定序列，稱為原型間隔區相鄰基序或PAM，以允許其識別靶位點。

例如，最廣泛使用的Cas9酶— —釀膿鏈球菌（SpCas9）的PAM序列，需要靶位點下游的一個5'-NGG-3'基序，顯著限制其可靶向的位置數量（大約是基因組上約9.9％的位點）。

近日，麻省理工學院的科學家開發了更通用的CRISPR系統，一種PAM限制性要求更低的“升級版”Cas9酶，能靶向幾乎一半的基因組序列，顯著擴大了CRISPR的應用潛力。該研究於10月24日刊登在Science Advance上。

從左到右：Joseph Jacobson、Pranam Chatterjee、Noah Jakimo

領導這項研究的Joseph Jacobson博士說：“CRISPR就像一個非常準確和高效的郵政系統，只要郵政編碼以零結尾，你就可以到達想要去的任何地方。因此它非常準確和具體，但同時也限制了你可以去的地點數量。”

ScCas9：由自然進化而來

為了開發更通用的CRISPR系統，研究人員利用了計算算法來對細菌序列進行生物信息學檢索，以確定是否存在任何類似的Cas9酶，對PAM限制性要求較低。為了進行搜索，研究人員還開發了一種數據分析軟件工具，他們稱之為SPAMALOT（通過目標對齊搜索PAM）。

在此之前，雖然科學家們已經對許多Cas9同源物進行了測序，但只有屈指可數的鏈球菌直系同源物被鑑定或功能驗證。

本次研究中，來自犬鏈球菌（S. canis）的Cas9酶（ScCas9）脫穎而出。ScCas9是一種高度相似的SpCas9直向同源物

限制性更低

研究人員通過使用ScCas9與SpCas9，以及針對具有不同PAM序列的天然基因組基因座（VEGFA）的sgRNA共轉染人胚胎腎-293T細胞（HEK293T），來比較它們在人細胞中的PAM特異性。

檢測到的基因修飾率證明：

• 在含有重疊5'-GGGT-3'PAM的目標位點上，SpCas9和ScCas9具有相當的編輯活性
• SpCas9的切割活性在其他非5'-NGG-3'序列中受損
• ScCas9在含有各種非重疊5'-NNGN-3'PAM序列的所有測試靶標上保持與SpCas9在5'-NGG-3'靶標上的相當活性

進一步的研究發現，在所有含5'-NNGN-3'PAM序列的目標位點中，ScCas9-ABE單鹼基編輯系統也有顯著的鹼基編輯效率

人體細胞中ScCas9和SpCas9 PAM的特異性

總之，ScCas9可以作為SpCas9用於哺乳動物細胞中的基因組編輯的有效替代物，它對共有的5'-NGG-3'和5'-NNGN-3'PAM序列都具有親和力。

這意味著，新的CRISPR系統能在基因組上開闢更多的位置，允許其靶向許多先前已經超出系統範圍的疾病特異性突變。

例如，一個典型的基因長度約為1000個鹼基，如果他們的目的是簡單地敲除整個基因，研究人員可以找到許多不同的定位點（PAM序列）。然而，許多疾病，例如鐮狀細胞性貧血，是由單一鹼基的突變引起的，使得它們更難以靶向。

準確性顯著提高

研究人員對先前報道的3個SpCas9高頻脫靶位點進行分析，以評估SpCas9和ScCas9對它們的修飾活性。

與先前報道的數據一致，SpCas9在所有3個檢查目標上顯示出高的直接靶向。

ScCas9顯示3種靶標的靶向活性相當，但在其中2個位點（VEGFA位點3和DNMT1位點4）上的脫靶活性可忽略不計，而在另一個位點（FANCF位點2）的脫靶比率降低近1.5倍。

結果表明：在兩者共有的5'-NGG-3'靶標上，ScCas9的基因編輯準確性顯著提高。

脫靶效率的比較

ScCas9是基礎版SpCas9的變體，兩者的氨基酸序列非常相似，因此預期它也很容易以重組蛋白的形式進行生產，並且可以直接受益於現在SpCas9的所有開發流程。

此外，ScCas9使用與SpCas9相同的gRNA，因此可以在目前已有的不同公司購買合成gRNA。

Jacobson表示，希望利用他們的技術能夠找到進一步擴展CRISPR系統靶向範圍、並且不會降低其準確性的其他酶，從而能夠追蹤基因組上的每個地址。

今年2月，CRISPR領域“大神”David R. Liu的團隊通過改造，獲得了xCas9— —可以廣泛識別多種PAM序列（包括NG、GAA和GAT），編輯範圍至少增加了4倍，可以靶向編輯基因組的1/4區域。

Jacobson等人表示，ScCas9擴展了目前使用的Cas9酶的基因靶向範圍。隨著進一步的發展，預計ScCas9和其他具有擴展靶向範圍的Cas9直向同源物會擴大鏈球菌Cas9工具包，增強當前的CRISPR系統。

推薦閱讀：科學家找到比Cas9更有效、更安全的酶，能使CRISPR基因編輯工具更好地工作丨醫麥猛爆料

參考出處：

http://news.mit.edu/2018/new-crispr-tool-opens-genome-editing-1024

http://advances.sciencemag.org/content/4/10/eaau0766

閱讀更多 醫麥客 的文章

關鍵字: 麻省理工 升級版 子刊