雷说新药专栏：02期
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01
药物靶标概况
在人类发现、利用药物的漫长历史中，早期因为缺乏系统详细的生命科学知识，药物的发现和应用大多靠偶然发现，如阿司匹林(乙酰水杨酸)、奎宁(金鸡纳霜)、吗啡、青霉素等。随着生命科学理论日渐完善，人们对人体和疾病的认识加深，药物研发逐渐趋于合理设计。药物合理设计的起点是了解疾病机制，确定可成药的靶标(target)。药物靶标一般指人体和病原体中可以与药物相互作用的分子，包括酶、受体、离子通道、转运蛋白、核酸等。此外还有其他一些治疗靶标，如蛋白-蛋白相互作用、核酸(DNA/RNA)-蛋白相互作用。不同类型的药物与靶标之间存在着多种多样的作用方式(图表1)。
图表1. 药物与靶标及作用方式
来源：公开信息，中康产业资本研究中心
人类和病原体基因组测序为寻找潜在的药物靶标提供了线索。人类基因组计划显示人体有2~2.5万个蛋白质编码基因，而病原体微生物虽小，但也含有数量可观的蛋白编码基因。需要注意的是，并不是所有基因的表达产物都可作为药物靶标，用于药物治疗的有效靶标应该是可药用基因组和致病基因的交叉部分(图表1)。2006年发表于Nature的一项研究表明约有5000个潜在的大分子靶点适于小分子化药开发，另外约有3200个靶点可能适用于生物学治疗。
图表2. 药物靶标示意
来源：公开信息，中康产业资本研究中心
潜在的药物靶标数量比较可观，共有约8200个，但目前针对这些靶标的药物开发情况怎样了呢？据统计，2006年全球有超过21000个上市药物，但是除去补充剂、造影剂、显像剂、维生素、母核相同的盐等，真正起到疾病治疗作用的、结构不同的分子仅有1400个，包括1204个小分子化药和166个大分子生物药，作用靶标总计324个，不到潜在靶标总量的4%。随着人们对疾病在分子层面机制的深入理解、预测模型和技术的持续进步，药物靶标的数量在不断增加。表面上看，药物研发的靶标池似乎已经相当宽广，但是在实际研发中，药企仍然遭遇因靶点选择偏差引起的失败。药物研发靶点偏差的原因主要有两类，对疾病机制的认知不足，以及药物在体内的脱靶效应。
02
靶点偏差原因之一：疾病认知
虽然部分靶标与某些疾病存在理论上的联系，但尚未通过任何药物来证明其与疾病存在着密切联系。在这种情况下，如果制药企业仅凭理论层面对疾病的认知就开始研发药物，试图冲击同类首创(first-in-class)，将会承担较大的风险。
低密度脂蛋白(LDL)会将其结合的胆固醇沉积在动脉血管壁上形成动脉粥样硬化斑，引起血管堵塞，而高密度脂蛋白(HDL)可以将血管组织中的胆固醇转移至肝脏分解，从而清除动脉粥样硬化斑，维持血管畅通。CETP(胆固醇酯转运蛋白)是血浆中的一种糖蛋白，在循环中与HDL结合，将胆固醇从高密度脂蛋白(HDL)转移到低密度脂蛋白(LDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)，再沉积在动脉血管壁上，提高了心血管病的风险。CETP抑制剂可阻碍以上过程，提高血浆中的高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平，减少胆固醇在血管壁上的沉积，从而降低心血管疾病(CVD)的风险。
在动物模型试验中，针对兔子的研究发现抑制CETP能够提高HDL水平，降低动脉粥样硬化的发生率。虽然他汀类血脂调节药的应用较早，但只能降低约25%的主要心血管事件风险，而且约有20%使用他汀类药物的人群会产生药物相关副作用。由于CETP抑制剂在理论上的可行性、较好的临床前数据，以及未被满足的临床需求，全球制药企业对CETP抑制剂的研发投入了极大的热情。辉瑞、罗氏、默沙东、礼来纷纷在CETP抑制剂领域布局，将托塞匹布(torcetrapib)、达塞匹布(dalcetrapib)、安塞匹布(anacetrapib)、evacetrapib推进至临床阶段。
图表3. CETP及其抑制剂的作用机制(达塞匹布为例)
来源：Vasc Health Risk Manag，中康产业资本研究中心
对于辉瑞的托塞匹布，临床数据证明其确实可增加HDL水平并降低LDL水平，具有一定的临床疗效。然而，在关键性III期临床研究ILLUMINATE中，托塞匹布会引起受试者血压升高，并增加死亡和心血管事件的风险。2006年末，辉瑞终止了历时15年、耗资8亿美元的托塞匹布研发项目，导致市值蒸发210亿美元。2012年，罗氏在对达塞匹布的III期试验进行中期评估后发现其在提高HDL-C方面缺乏疗效，于当年终止了达塞匹布的临床研究。2015年，独立数据检查委员会认为礼来的evacetrapib没有充分的疗效，礼来据此终止了该药的研发。
在辉瑞、罗氏、礼来相继折戟之后，默沙东仍在小心翼翼的推进安塞匹布的临床研究。默沙东在DEFINE(n=1600)研究中发现，安塞匹布可将患者的HDL水平提高138.1%，LDL水平降低39.8%，并且不会引发高血压或增加心血管疾病相关死亡的风险。2017年6月，超过3万名患者的REVEAL研究结果显示安塞匹布/阿托伐他汀治疗组、安慰剂/阿托伐他汀治疗组的心血管事件发生率分别为10.8%和11.8%。虽然达到主要终点，但相比参照组仅降低9%的心血管事件风险，显然无法与疗效更确切的PCSK-9单抗竞争。2017年10月，默沙东宣布放弃安塞匹布的上市申请。随后，安进也终止了对CETP抑制剂obicetrapib的研发。
默沙东、罗氏和礼来曾一致认为，托塞匹布失败的原因可能是药物分子本身缺陷导致的脱靶效应，从而导致血压升高、电解质失衡及醛固酮水平异常等问题。诚然，这三家公司的CETP抑制剂通过更合理的结构设计和优化，确实没有出现托塞匹布的安全性问题，但最终仍然难逃失败。这些药物相继失败的主要原因应该是CETP和各种脂蛋白之间的结合方式以及胆固醇从HDL向LDL转移的机理未被确定。HDL的成分非常复杂，无法确定CETP抑制剂影响的是何种HDL，以及何种HDL能够减缓动脉粥样硬化的疾病进程。当然，也不能完全排除脱靶作用或者药代动力学(PK)上的问题导致这些CETP抑制剂的失败。
托塞匹布等CETP抑制剂的失败凸显了选择未经临床验证的新靶点存在较大风险，除了对靶点在疾病中的作用机制认知不够充分，其他与靶点机制无关的因素也可能使临床试验结果不达预期。然而，首创(first-in-class)新药通常会带来巨额经济回报，这又鼓励制药企业不断地尝试和努力。
03
靶点偏差原因之二：脱靶效应
脱靶效应(off-target effects)指药物与设计之外的其他靶标发生作用，经常会导致意想不到的药物副作用。在药物临床前筛选中，如果脱靶作用引起较严重的副作用，则会被去除。然而，体外筛选并不能完美模拟人体内复杂的环境，有些通过体外筛选的药物在人体试验时会表现出较强的脱靶效应，甚至可能与设计的靶点毫无相互作用。
2019年9月，《Science Translational Medicine》上发表的一篇论文显示，目前至少有10种处于临床阶段的抗癌药并未靶向预期靶标。此前，数十篇学术论文证明MELK(maternalembryonic leucine zipper kinase，母体胚胎亮氨酸拉链激酶)蛋白的过度表达是乳腺癌细胞增殖的重要因素，但是在使用CRISPR技术敲除了编码该蛋白的基因后，癌细胞的生长并未受到任何影响。更加令人震惊的是，先前认为靶向MELK的抗癌药仍能很好地抑制MELK基因敲除后的癌细胞的增殖。这表明此前对MELK蛋白的认知错误，而且此抗癌药的靶标也不是MELK蛋白。
在发现MELK靶向药的脱靶问题之后，研究人员用同样的方法测试10种临床在研靶向药物的靶向性。这些药物靶向CASP3、HDAC6、MAPK14、PAK4、PBK以及PIM1等靶点，这些靶点此前已被证明与癌症的发生发展相关。研究人员用CRISPR-Cas9技术敲除了癌症细胞系中相应靶点的基因，结果表明在靶点基因被敲除后，癌细胞的生长都未受到显著影响，表现为α-TUB(α微管蛋白基因启动子)未有显著变化(图表4)。
图表4. 靶点基因敲除并未影响癌细胞生长
来源：Sci Trans Med，中康产业资本研究中心
研究认为目前药物研发所针对的靶标是用多年以前的技术发现的，可能靶标本身并不准确。在CRISPR基因编辑技术之前，研究者使用RNA干扰(RNAi)来阻止癌细胞产生特定蛋白，如果能够阻止癌细胞增殖，则认为该蛋白可能为有效靶标。然而，这种方法并未考虑到被杀伤后存活的突变癌细胞会改变其蛋白质结构或信号通路，从而对原先的抗癌药产生耐药性。这说明，大量的抗癌药临床试验失败可能是因为随着癌细胞的突变，原先的靶标失效。
04
“不可成药”靶点的突破
药物要发挥药理作用，必须与特定靶标生物大分子(通常为蛋白质)结合。影响药物与靶标结合的重要条件是药物分子的尺寸和形状尽量适应蛋白质表面的空腔，即“结合口袋”。参照化学中配合物的概念，通常可将小分子药物称为配体，将膜结合蛋白或可溶性蛋白(或蛋白复合物)称为受体。配体除了尺寸和形状与受体的空腔匹配，表面性质也必须匹配，从而发生特异性相互作用。一些蛋白质分子因为特殊的空间结构，导致表面没有空腔，从而难以与药物发生较强的相互作用，这些分子被视为不可成药靶点。
RAS基因突变广泛存在于胰腺癌、结直肠癌、非小细胞肺癌等多种癌细胞中，但长期以来，相关小分子靶向药的开发一直未有突破，被视为不可成药靶点。分子生物学发现RAS蛋白结构平滑，没有明显的可与小分子结合的疏水性口袋。RAS家族蛋白包括KRAS、HRAS、NRAS，其中KRAS突变比例超过80%，并且多数KRAS基因突变发生于12号密码子，表达为KRAS G12C突变蛋白。KRAS G12C突变在非小细胞肺癌中比例较大(14%)，在结直肠癌(4%)、胰腺癌(2%)中也有一定占比。
RAS蛋白通过在与GDP(二磷酸鸟苷)结合的非激活状态和与GTP(三磷酸鸟苷)结合的激活状态之间切换，来调控下游通路，从而影响细胞的生长和分化，以及肿瘤的发生和发展。UCLA的Kevan Schokat教授团队发现，小分子共价化合物可靶向KRAS突变基因12号密码子编码的半胱氨酸残基，诱导临近的分子开关II号区域形成可扩张疏水口袋，随后小分子化合物填入这个口袋，将KRAS G12C蛋白不可逆地锁定在与GDP结合的非激活状态，从而阻断依赖该蛋白的信号通路和癌细胞的生存能力。基于这个发现，MiratiTherapeutics公司研发了MRTX849，并于2019年启动I/II期临床试验，单药治疗或与其他抗癌药联用治疗携带KRAS G12C突变的实体瘤患者。
图表5. MRTX849共价抑制KRAS G12C蛋白
来源：Mirati官网，中康产业资本研究中心
通过先与靶标上某个位点作用，随后在分子间作用力、静电作用、氢键等相互作用下，诱导改变靶标的空间结构，产生可结合的空腔，从而将将先前的“不可成药”靶点转化为可成药靶点。除了这种“诱导结合”策略，基于泛素化和蛋白酶体的PROTAC(靶向蛋白降解联合体)技术近年来脱颖而出。这种技术不同于传统靶向药物通过与靶标结合影响其功能的作用机制，而是直接将靶蛋白降解，从而达到治疗效果。从2013年起，该技术就引起了许多药企的关注，直到2019年3月，Arvinas公司的雄激素受体(AR)降解剂ARV-110进入治疗前列腺癌的I期临床，成为首个进入临床阶段的PROTAC分子。
PROTAC是一种“杠铃状”的双特异性分子，一端靶向需要降解的靶蛋白，另一端靶向E3泛素化链接酶，中间是“细长”的连接链(linker)。这三者连接后形成“靶蛋白-PROTAC-E3连接酶(E3 ligase)和泛素(ubiquitin)”的联合体，使靶蛋白与泛素在空间上紧密靠近，从而将靶蛋白泛素化，在体内通过泛素-蛋白酶体(proteasome)途径降解，释放出的PROTAC分子又可以参与下一个靶蛋白的降解。在这个过程中，PROTAC起到了催化剂的作用，较少的剂量即可实现高效的降解。
图表6. PROTAC作用机制示意
来源：XVIVO网站，中康产业资本研究中心
靶向药物通常需要与靶蛋白的活性位点结合发挥作用，而PROTAC分子理论上可通过与靶蛋白上的任意位点结合，即可将其降解。这一方面扩大了靶点范围，另一方面可能是潜在的缺点。传统靶向药物一般不会完全抑制靶蛋白的活性，通常也不会影响靶蛋白的表达，这固然增加了耐药性发生的概率，但如果用PROTAC将靶蛋白彻底降解，可能会因该蛋白缺失带来无法预知的不良反应。另外一个隐患是可能会因脱靶效应降解其他正常蛋白，而这种脱靶效应在临床前筛选中不易发现，增加了后续开发的风险。
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怎样选择药物靶标
以上讨论了在创新药研发过程中靶标的偏差，以及对于传统“不可成药”靶点的突破，那么对于新药研发，怎样才能选择一个理想的药物靶标呢？发现并评估一个药物靶标的潜在治疗获益不仅基于实验、机理和药学研究，而且要基于理论上的分子成药性评估、对潜在副作用的早期评估以及关于商业化机会的考虑。2009年，拜耳(Bayer)提出了“Grants4Targets”倡议，其出发点是为学术界提供过渡性资助和药物发现技术，以支持对新的药物靶标的评估和验证。拜耳的倡议收到了很多高质量、有价值的新药靶标提议，但愈发感到好的药物靶标的关键性质难以全面清晰地界定，但是一般来说具有或符合以下性质。
图表7. 理想的药物靶标的性质
来源：拜耳医药，中康产业资本研究中心
以上只是泛泛地给出了一个好的药物靶标通常应该具有的性质，但在实际药物研发中则需要经过严谨的的靶标识别、验证、评估，基本上围绕上表中的性质详细展开，限于篇幅，在此就不展开讨论了。
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结语
创新药是近年来中国制药行业的热门话题，而合理的靶标选择则是创新药研发的起点。靶点“扎堆”是中国创新药行业的突出问题，选择相对成熟的靶点在一定程度上能够减少失败的风险，但随之而来的同质化竞争则极大地压缩了产品的利润空间。类似于抢首仿的同质化仿创研发不利于中国创新药行业水平的提升。中国的创新药行业要达到第一梯队，必须勇于探索，敢于尝试新的药物靶标，力争开发国际首创新药。在中国科研、投资、人才、药监等多方面的协同发展下，中国创新药行业一定能走出一条康庄大道。
