雷說新藥專欄：02期
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01
藥物靶標概況
在人類發現、利用藥物的漫長曆史中，早期因為缺乏系統詳細的生命科學知識，藥物的發現和應用大多靠偶然發現，如阿司匹林(乙酰水楊酸)、奎寧(金雞納霜)、嗎啡、青黴素等。隨著生命科學理論日漸完善，人們對人體和疾病的認識加深，藥物研發逐漸趨於合理設計。藥物合理設計的起點是瞭解疾病機制，確定可成藥的靶標(target)。藥物靶標一般指人體和病原體中可以與藥物相互作用的分子，包括酶、受體、離子通道、轉運蛋白、核酸等。此外還有其他一些治療靶標，如蛋白-蛋白相互作用、核酸(DNA/RNA)-蛋白相互作用。不同類型的藥物與靶標之間存在著多種多樣的作用方式(圖表1)。
圖表1. 藥物與靶標及作用方式
來源：公開信息，中康產業資本研究中心
人類和病原體基因組測序為尋找潛在的藥物靶標提供了線索。人類基因組計劃顯示人體有2~2.5萬個蛋白質編碼基因，而病原體微生物雖小，但也含有數量可觀的蛋白編碼基因。需要注意的是，並不是所有基因的表達產物都可作為藥物靶標，用於藥物治療的有效靶標應該是可藥用基因組和致病基因的交叉部分(圖表1)。2006年發表於Nature的一項研究表明約有5000個潛在的大分子靶點適於小分子化藥開發，另外約有3200個靶點可能適用於生物學治療。
圖表2. 藥物靶標示意
來源：公開信息，中康產業資本研究中心
潛在的藥物靶標數量比較可觀，共有約8200個，但目前針對這些靶標的藥物開發情況怎樣了呢？據統計，2006年全球有超過21000個上市藥物，但是除去補充劑、造影劑、顯像劑、維生素、母核相同的鹽等，真正起到疾病治療作用的、結構不同的分子僅有1400個，包括1204個小分子化藥和166個大分子生物藥，作用靶標總計324個，不到潛在靶標總量的4%。隨著人們對疾病在分子層面機制的深入理解、預測模型和技術的持續進步，藥物靶標的數量在不斷增加。表面上看，藥物研發的靶標池似乎已經相當寬廣，但是在實際研發中，藥企仍然遭遇因靶點選擇偏差引起的失敗。藥物研發靶點偏差的原因主要有兩類，對疾病機制的認知不足，以及藥物在體內的脫靶效應。
02
靶點偏差原因之一：疾病認知
雖然部分靶標與某些疾病存在理論上的聯繫，但尚未通過任何藥物來證明其與疾病存在著密切聯繫。在這種情況下，如果製藥企業僅憑理論層面對疾病的認知就開始研發藥物，試圖衝擊同類首創(first-in-class)，將會承擔較大的風險。
低密度脂蛋白(LDL)會將其結合的膽固醇沉積在動脈血管壁上形成動脈粥樣硬化斑，引起血管堵塞，而高密度脂蛋白(HDL)可以將血管組織中的膽固醇轉移至肝臟分解，從而清除動脈粥樣硬化斑，維持血管暢通。CETP(膽固醇酯轉運蛋白)是血漿中的一種糖蛋白，在循環中與HDL結合，將膽固醇從高密度脂蛋白(HDL)轉移到低密度脂蛋白(LDL)和極低密度脂蛋白(VLDL)，再沉積在動脈血管壁上，提高了心血管病的風險。CETP抑制劑可阻礙以上過程，提高血漿中的高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平，減少膽固醇在血管壁上的沉積，從而降低心血管疾病(CVD)的風險。
在動物模型試驗中，針對兔子的研究發現抑制CETP能夠提高HDL水平，降低動脈粥樣硬化的發生率。雖然他汀類血脂調節藥的應用較早，但只能降低約25%的主要心血管事件風險，而且約有20%使用他汀類藥物的人群會產生藥物相關副作用。由於CETP抑制劑在理論上的可行性、較好的臨床前數據，以及未被滿足的臨床需求，全球製藥企業對CETP抑制劑的研發投入了極大的熱情。輝瑞、羅氏、默沙東、禮來紛紛在CETP抑制劑領域佈局，將託塞匹布(torcetrapib)、達塞匹布(dalcetrapib)、安塞匹布(anacetrapib)、evacetrapib推進至臨床階段。
圖表3. CETP及其抑制劑的作用機制(達塞匹布為例)
來源：Vasc Health Risk Manag，中康產業資本研究中心
對於輝瑞的託塞匹布，臨床數據證明其確實可增加HDL水平並降低LDL水平，具有一定的臨床療效。然而，在關鍵性III期臨床研究ILLUMINATE中，託塞匹佈會引起受試者血壓升高，並增加死亡和心血管事件的風險。2006年末，輝瑞終止了歷時15年、耗資8億美元的託塞匹布研發項目，導致市值蒸發210億美元。2012年，羅氏在對達塞匹布的III期試驗進行中期評估後發現其在提高HDL-C方面缺乏療效，於當年終止了達塞匹布的臨床研究。2015年，獨立數據檢查委員會認為禮來的evacetrapib沒有充分的療效，禮來據此終止了該藥的研發。
在輝瑞、羅氏、禮來相繼折戟之後，默沙東仍在小心翼翼的推進安塞匹布的臨床研究。默沙東在DEFINE(n=1600)研究中發現，安塞匹布可將患者的HDL水平提高138.1%，LDL水平降低39.8%，並且不會引發高血壓或增加心血管疾病相關死亡的風險。2017年6月，超過3萬名患者的REVEAL研究結果顯示安塞匹布/阿託伐他汀治療組、安慰劑/阿託伐他汀治療組的心血管事件發生率分別為10.8%和11.8%。雖然達到主要終點，但相比參照組僅降低9%的心血管事件風險，顯然無法與療效更確切的PCSK-9單抗競爭。2017年10月，默沙東宣佈放棄安塞匹布的上市申請。隨後，安進也終止了對CETP抑制劑obicetrapib的研發。
默沙東、羅氏和禮來曾一致認為，託塞匹布失敗的原因可能是藥物分子本身缺陷導致的脫靶效應，從而導致血壓升高、電解質失衡及醛固酮水平異常等問題。誠然，這三家公司的CETP抑制劑通過更合理的結構設計和優化，確實沒有出現託塞匹布的安全性問題，但最終仍然難逃失敗。這些藥物相繼失敗的主要原因應該是CETP和各種脂蛋白之間的結合方式以及膽固醇從HDL向LDL轉移的機理未被確定。HDL的成分非常複雜，無法確定CETP抑制劑影響的是何種HDL，以及何種HDL能夠減緩動脈粥樣硬化的疾病進程。當然，也不能完全排除脫靶作用或者藥代動力學(PK)上的問題導致這些CETP抑制劑的失敗。
託塞匹布等CETP抑制劑的失敗凸顯了選擇未經臨床驗證的新靶點存在較大風險，除了對靶點在疾病中的作用機制認知不夠充分，其他與靶點機制無關的因素也可能使臨床試驗結果不達預期。然而，首創(first-in-class)新藥通常會帶來鉅額經濟回報，這又鼓勵製藥企業不斷地嘗試和努力。
03
靶點偏差原因之二：脫靶效應
脫靶效應(off-target effects)指藥物與設計之外的其他靶標發生作用，經常會導致意想不到的藥物副作用。在藥物臨床前篩選中，如果脫靶作用引起較嚴重的副作用，則會被去除。然而，體外篩選並不能完美模擬人體內複雜的環境，有些通過體外篩選的藥物在人體試驗時會表現出較強的脫靶效應，甚至可能與設計的靶點毫無相互作用。
2019年9月，《Science Translational Medicine》上發表的一篇論文顯示，目前至少有10種處於臨床階段的抗癌藥並未靶向預期靶標。此前，數十篇學術論文證明MELK(maternalembryonic leucine zipper kinase，母體胚胎亮氨酸拉鍊激酶)蛋白的過度表達是乳腺癌細胞增殖的重要因素，但是在使用CRISPR技術敲除了編碼該蛋白的基因後，癌細胞的生長並未受到任何影響。更加令人震驚的是，先前認為靶向MELK的抗癌藥仍能很好地抑制MELK基因敲除後的癌細胞的增殖。這表明此前對MELK蛋白的認知錯誤，而且此抗癌藥的靶標也不是MELK蛋白。
在發現MELK靶向藥的脫靶問題之後，研究人員用同樣的方法測試10種臨床在研靶向藥物的靶向性。這些藥物靶向CASP3、HDAC6、MAPK14、PAK4、PBK以及PIM1等靶點，這些靶點此前已被證明與癌症的發生發展相關。研究人員用CRISPR-Cas9技術敲除了癌症細胞系中相應靶點的基因，結果表明在靶點基因被敲除後，癌細胞的生長都未受到顯著影響，表現為α-TUB(α微管蛋白基因啟動子)未有顯著變化(圖表4)。
圖表4. 靶點基因敲除並未影響癌細胞生長
來源：Sci Trans Med，中康產業資本研究中心
研究認為目前藥物研發所針對的靶標是用多年以前的技術發現的，可能靶標本身並不準確。在CRISPR基因編輯技術之前，研究者使用RNA干擾(RNAi)來阻止癌細胞產生特定蛋白，如果能夠阻止癌細胞增殖，則認為該蛋白可能為有效靶標。然而，這種方法並未考慮到被殺傷後存活的突變癌細胞會改變其蛋白質結構或信號通路，從而對原先的抗癌藥產生耐藥性。這說明，大量的抗癌藥臨床試驗失敗可能是因為隨著癌細胞的突變，原先的靶標失效。
04
“不可成藥”靶點的突破
藥物要發揮藥理作用，必須與特定靶標生物大分子(通常為蛋白質)結合。影響藥物與靶標結合的重要條件是藥物分子的尺寸和形狀儘量適應蛋白質表面的空腔，即“結合口袋”。參照化學中配合物的概念，通常可將小分子藥物稱為配體，將膜結合蛋白或可溶性蛋白(或蛋白複合物)稱為受體。配體除了尺寸和形狀與受體的空腔匹配，表面性質也必須匹配，從而發生特異性相互作用。一些蛋白質分子因為特殊的空間結構，導致表面沒有空腔，從而難以與藥物發生較強的相互作用，這些分子被視為不可成藥靶點。
RAS基因突變廣泛存在於胰腺癌、結直腸癌、非小細胞肺癌等多種癌細胞中，但長期以來，相關小分子靶向藥的開發一直未有突破，被視為不可成藥靶點。分子生物學發現RAS蛋白結構平滑，沒有明顯的可與小分子結合的疏水性口袋。RAS家族蛋白包括KRAS、HRAS、NRAS，其中KRAS突變比例超過80%，並且多數KRAS基因突變發生於12號密碼子，表達為KRAS G12C突變蛋白。KRAS G12C突變在非小細胞肺癌中比例較大(14%)，在結直腸癌(4%)、胰腺癌(2%)中也有一定佔比。
RAS蛋白通過在與GDP(二磷酸鳥苷)結合的非激活狀態和與GTP(三磷酸鳥苷)結合的激活狀態之間切換，來調控下游通路，從而影響細胞的生長和分化，以及腫瘤的發生和發展。UCLA的Kevan Schokat教授團隊發現，小分子共價化合物可靶向KRAS突變基因12號密碼子編碼的半胱氨酸殘基，誘導臨近的分子開關II號區域形成可擴張疏水口袋，隨後小分子化合物填入這個口袋，將KRAS G12C蛋白不可逆地鎖定在與GDP結合的非激活狀態，從而阻斷依賴該蛋白的信號通路和癌細胞的生存能力。基於這個發現，MiratiTherapeutics公司研發了MRTX849，並於2019年啟動I/II期臨床試驗，單藥治療或與其他抗癌藥聯用治療攜帶KRAS G12C突變的實體瘤患者。
圖表5. MRTX849共價抑制KRAS G12C蛋白
來源：Mirati官網，中康產業資本研究中心
通過先與靶標上某個位點作用，隨後在分子間作用力、靜電作用、氫鍵等相互作用下，誘導改變靶標的空間結構，產生可結合的空腔，從而將將先前的“不可成藥”靶點轉化為可成藥靶點。除了這種“誘導結合”策略，基於泛素化和蛋白酶體的PROTAC(靶向蛋白降解聯合體)技術近年來脫穎而出。這種技術不同於傳統靶向藥物通過與靶標結合影響其功能的作用機制，而是直接將靶蛋白降解，從而達到治療效果。從2013年起，該技術就引起了許多藥企的關注，直到2019年3月，Arvinas公司的雄激素受體(AR)降解劑ARV-110進入治療前列腺癌的I期臨床，成為首個進入臨床階段的PROTAC分子。
PROTAC是一種“槓鈴狀”的雙特異性分子，一端靶向需要降解的靶蛋白，另一端靶向E3泛素化鏈接酶，中間是“細長”的連接鏈(linker)。這三者連接後形成“靶蛋白-PROTAC-E3連接酶(E3 ligase)和泛素(ubiquitin)”的聯合體，使靶蛋白與泛素在空間上緊密靠近，從而將靶蛋白泛素化，在體內通過泛素-蛋白酶體(proteasome)途徑降解，釋放出的PROTAC分子又可以參與下一個靶蛋白的降解。在這個過程中，PROTAC起到了催化劑的作用，較少的劑量即可實現高效的降解。
圖表6. PROTAC作用機制示意
來源：XVIVO網站，中康產業資本研究中心
靶向藥物通常需要與靶蛋白的活性位點結合發揮作用，而PROTAC分子理論上可通過與靶蛋白上的任意位點結合，即可將其降解。這一方面擴大了靶點範圍，另一方面可能是潛在的缺點。傳統靶向藥物一般不會完全抑制靶蛋白的活性，通常也不會影響靶蛋白的表達，這固然增加了耐藥性發生的概率，但如果用PROTAC將靶蛋白徹底降解，可能會因該蛋白缺失帶來無法預知的不良反應。另外一個隱患是可能會因脫靶效應降解其他正常蛋白，而這種脫靶效應在臨床前篩選中不易發現，增加了後續開發的風險。
05
怎樣選擇藥物靶標
以上討論了在創新藥研發過程中靶標的偏差，以及對於傳統“不可成藥”靶點的突破，那麼對於新藥研發，怎樣才能選擇一個理想的藥物靶標呢？發現並評估一個藥物靶標的潛在治療獲益不僅基於實驗、機理和藥學研究，而且要基於理論上的分子成藥性評估、對潛在副作用的早期評估以及關於商業化機會的考慮。2009年，拜耳(Bayer)提出了“Grants4Targets”倡議，其出發點是為學術界提供過渡性資助和藥物發現技術，以支持對新的藥物靶標的評估和驗證。拜耳的倡議收到了很多高質量、有價值的新藥靶標提議，但愈發感到好的藥物靶標的關鍵性質難以全面清晰地界定，但是一般來說具有或符合以下性質。
圖表7. 理想的藥物靶標的性質
來源：拜耳醫藥，中康產業資本研究中心
以上只是泛泛地給出了一個好的藥物靶標通常應該具有的性質，但在實際藥物研發中則需要經過嚴謹的的靶標識別、驗證、評估，基本上圍繞上表中的性質詳細展開，限於篇幅，在此就不展開討論了。
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結語
創新藥是近年來中國製藥行業的熱門話題，而合理的靶標選擇則是創新藥研發的起點。靶點“扎堆”是中國創新藥行業的突出問題，選擇相對成熟的靶點在一定程度上能夠減少失敗的風險，但隨之而來的同質化競爭則極大地壓縮了產品的利潤空間。類似於搶首仿的同質化仿創研發不利於中國創新藥行業水平的提升。中國的創新藥行業要達到第一梯隊，必須勇於探索，敢於嘗試新的藥物靶標，力爭開發國際首創新藥。在中國科研、投資、人才、藥監等多方面的協同發展下，中國創新藥行業一定能走出一條康莊大道。
