核衣壳磷酸化在核衣壳解聚及CCC DNA形成中的关键机制
完整的乙型肝炎病毒(HBV)颗粒会向宿主细胞核递送一个部分双链、松弛的环状(RC) DNA基因组，并将其转化为共价闭合环状(CCC) DNA，从而建立和维持病毒感染。
CCC DNA可以转录包括前体基因组RNA (pgRNA)在内的所有种类的RNA，介导病毒的表达以及复制。pgRNA经过病毒核心(HBc)蛋白包装成不成熟的核衣壳，并在核衣壳中被逆转录为RC DNA形成成熟的核衣壳。核衣壳成熟后被病毒膜蛋白和细胞脂膜包裹进而分泌到胞外最终成为完整的病毒颗粒，或将RCDNA重新递送到细胞核内补充细胞核内的CCCDNA存量。
无论是来自细胞外的病毒颗粒还是来自细胞内成熟核衣壳的RC DNA，都必须在核衣壳解聚后才能成功递送RCDNA到细胞核内并形成CCCDNA。
图1.HBc NTD二聚体的三维结构与潜在的NTD磷酸化位点S44，S49的位置。两个HBcNTD单体(分别为棕色和暗红色)在其二聚体中的结构如图所示，该二聚体三维结构图是基于HBV核衣壳晶体结构所做[1]。位于核衣壳内侧表面的两个潜在NTD磷酸化位点S44和S49被标示为黄色。
人们已经证实HBc会在其C末端区域(CTD)进行磷酸化和去磷酸化以促进pgRNA的包装和逆转录。而已知的脯氨酸依赖的蛋白激酶主要有两类，即可磷酸化S(T)- P位点的细胞蛋白激酶：CDKs和MAPKs[2]。
鉴于我们最近发现了被包装在HBV衣壳中的主要内源性激酶是细胞周期蛋白依赖性激酶2 (CDK2,至少是一个密切相关的激酶)[3]，我们推测：在病毒复制的某些阶段，包装好的CDK2可以使NTD S-P位点磷酸化，从而调节HBc的功能。为了测试这种可能性，我们仔细筛查了HBcNTD序列并发现了两个保守的潜在磷酸化位点：S44和S49(图1)。这两个位点都位于核衣壳内侧表面，因此它们在核衣壳组装完成后将无法被胞质内激酶识别，却能够被包装在衣壳内的激酶所识别。
在本研究中，我们将S44和S49两个位点都突变为Ala (N2A)以阻止其磷酸化，又将这两个位点都突变为Glu (N2E)以模拟磷酸化(并阻止去磷酸化)。我们用这些突变体在支持HBV复制的人肝癌细胞和原代肝细胞内分别进行了瞬时转染实验和感染实验，分析这些突变对HBV复制不同阶段的影响以及对HBc磷酸化状态的影响。
实验结果显示突变体N2A可以支持病毒的衣壳组装、pgRNA包装、逆转录以及病毒颗粒分泌等步骤，但却显著下调了CCC DNA的形成。另一方面，突变体N2E虽然在pgRNA包装上出现了缺陷，却增强了成熟NC解聚的效率并进一步促进了CCC DNA的形成。与此同时，N2E还有效增强了HBc的CTD和其他部位的磷酸化。我们的内源CDK2抑制实验还显示包装在病毒衣壳中的CDK2的活性有助于CCC DNA的形成。
这些结果促使我们提出了一个模型：HBc在核衣壳成熟过程中进行CTD的去磷酸化之后，包装在核衣壳内的CDK2促使了HBc在NTD和CTD的再次磷酸化，并通过破坏成熟的核衣壳来促进脱衣壳，RC DNA递送和CCC DNA的形成（图2）。
图2. HBc磷酸化-去磷酸化-再磷酸化循环调控NC组装、成熟和拆卸的模型。从pgRNA翻译后，HBc亚基在CTD (pCTD)被磷酸化，并在细胞质中结合RT蛋白和pgRNA组装成未成熟的NCs (Cyto)。在核衣壳成熟过程中，核衣壳内的pgRNA被RT蛋白逆转录为RC DNA，而同时进行的HBc去磷酸化可以促进RCDNA的合成和成熟核衣壳的稳定[4]。尽管成熟的核衣壳相对于不成熟的核衣壳而言依然是不稳定的(虚线与实线六边形)[5]。接下来成熟的核衣壳会在CDK2的催化下导致NTD和CTD (pNTD/pCTD)的再次磷酸化，这进一步破坏了它们的稳定性(间断线六边形)，并促进它们的解聚和RC DNA进入细胞核。
NTD突变对HBV CCC DNA水平影响的另一可能机制是其对成熟核衣壳核内转运的影响。虽然所有已知的HBc的核定位信号(NLSs)都处于CTD，而不是NTD，但人们发现CTD的磷酸化状态会影响HBc的核定位[6,7]。
而我们的研究结果暗示了潜在的NTD磷酸化可能会通过其对CTD磷酸化的影响进而调控成熟核衣壳的核内转运。另一方面CTD可能大部分都被包裹在核衣壳内，因此核衣壳的解聚也可以进一步帮助位于CTD的NLSs的暴露。此外，N2E增强了负链闭合（cM)RC DNA的水平，这很可能是CCCDNA形成过程中的中间产物[8]。
我们的结果表明N2E突变不仅通过增强核衣壳的解聚导致中间体cM RC DNA增多，还可能进入细胞核内影响了cM-RCDNA到CCC DNA的转化，而这也进一步导致了cM-RC DNA的积累甚至多于CCC DNA的积累(图2)。因此，HBc NTD磷酸化很可能在调节CCC DNA形成的途径上发挥更直接的作用，例如通过影响RC DNA或cM-RC DNA的亚核定位。这一结果进一步表明：在NC解聚后，至少在RCDNA转化为CCC DNA的某些阶段，HBc仍与RC DNA相关联。
在乙型肝炎的治疗领域，除了具有直接抗病毒和免疫调节活性的细胞因子I型干扰素外，目前所有被批准的治疗慢性乙型肝炎的药物都以病毒逆转录酶为靶点[9,10]。尽管它们在抑制乙肝病毒感染方面非常有效，但却不能完全根除乙肝病毒。这主要是由于病毒CCCDNA在受感染肝细胞内持续存在。而以HBc NTD为靶点的小分子化合物正被积极地作为潜在的治疗手段进行研究[11,12]。其中一些化合物可以抑制衣壳组装或pgRNA包装。
此外，在控制核衣壳解聚方面，HBc靶向化合物最近被证明可能通过调节核衣壳的解聚进而影响CCC DNA的形成[11-18]。我们的结果也进一步阐明，HBc靶向药物可能通过影响细胞核内的事件来影响核衣壳解聚后的CCC DNA形成。因此更好地理解HBV核衣壳的组装和解聚能为HBc靶向的新型抗HBV药物开发提供持续的理论支撑。
原文链接：https://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1008459
参考文献整理在石墨文档中：
https://shimo.im/docs/Xxqcyr3ThhHPgXJX/
