醫工薈萃，不是蘿蔔開會，融合創新才是硬道理！
重要更正
本俠在第十一講，也就是免疫組化第一講裡，介紹免疫組化步驟時，將“抗原修復”步驟說成了“蛋白復性”步驟，請大家寬容本俠筆誤。腦子裡東西太多，本俠遏制不住它們有時候自己往外蹦，嘻嘻嘻嘻。
上一講我們把切片說完了，記性好的小夥伴可能記得在免疫組化第一講（第十一講）裡本俠說過，完成免疫組化需要7步，現在我們說了第一步和第三步（第二步是石蠟包埋，本俠沒說，因為不會，但是可以找公司完成），還剩下四個步驟，這四個步驟我們統稱為“染色”
“染色”包括固定標本的抗原修復（未固定冰凍標本不需要修復操作，這裡請參考一下本俠自從寫blog以來首次發表的“重要說明”，在文末）、封閉、抗體孵育、顯色 。其實在抗原修復之前還有兩個步驟，是免疫組化特有的，因為是小動作同時又為了銜接之前Western的思維（如果不同方法從原理和操作上歸納得比較相似，就比較利於理解和掌握），本俠就沒有寫，這兩個步驟分別是：細胞通透（這個詞從字面上看，它所表達的意思可是一點也不通透啊，等會兒跟大家解釋）和滅活內源性過氧化物酶。這兩個步驟存在的原因也是之前我們提到的，免疫組化的樣本比較原汁原味，細胞可能是完整的（只要沒有被刀片從中間劈開），所以它就比Western所用的經過提煉和處理的蛋白樣本複雜的多，需要面對的因素也要多得多。
如果是做石蠟切片，在做抗原修復之前，還得再有一個額外的步驟，就是脫蠟。因為樣本是被埋在石蠟裡面的，如果帶著石蠟一起做染色，妥妥的是染不出來的，所以首先要把石蠟去除，這個步驟就叫做“脫蠟”。脫蠟用的試劑是“二甲苯”，因為石蠟能溶於二甲苯（兩者極性都很小，學過有機化學的小夥伴們一定聽過“相似相溶原理”）。但是固態的石蠟不易溶於二甲苯，所以在用二甲苯脫蠟之前，需要將切片放至60℃烘箱烤上45min（請參見小貼士1），待石蠟出現肉眼可見的融化，迅速將切片浸到二甲苯中，為了確保石蠟被溶解乾淨，二甲苯溶解石蠟的操作一般做兩遍。二甲苯處理完成，我們肯定不能把粘著二甲苯的切片拿去染色，得先把二甲苯洗掉，但是剛剛提到過，二甲苯極性很小，我們不可能用PBS或者水把它洗乾淨（因為水的極性很大），然而對於做染色來說，系統裡對染色影響最小的溶液也就是PBS或水了，怎麼才能把切片最後用PBS或者水來清洗呢？我們只能再次利用“相似相溶原理”一點點提升溶液的極性。
我們先用純的酒精來洗掉二甲苯，再用酒精和水的混合物（也就是高濃度或低濃度酒精）來不斷稀釋純的酒精以及殘留的二甲苯，最後用水來洗掉酒精，搞定！而且最後用水來洗片還可以達到所謂“水化”的效果，本俠沒查到能說服自己的原理，據說對染色很好，額……好吧。不過每次遇到這類操作，我都不禁感嘆，究竟是什麼樣的大神，上通天文、下知地理，才能想到這樣的方法，五體投地！脫蠟步驟
首先把切片放到染色架上（可以放多張片子），然後用繩子把染色架拴起來方便拿來拿去，尤其是放進染色缸的時候就太方便了。接著把染色架（當然上面有切片啦）放進烘箱讓石蠟融化，然後拎著染色架放進盛有二甲苯的染色缸，靜置15min，下面的流程是：二甲苯（另一個缸）15min；100%酒精2min；90%酒精2min；80%酒精2min；70%酒精2min；蒸餾水2min；蒸餾水（另一個缸）2min。這一套過程下來，脫蠟完成！所以這就意味著，你要準備8個大染色缸（下圖中不帶卡槽的那種），分別裝上上述流程的液體，液體的量需要至少能淹沒所有切片。
通透&滅活
為了保證在染色過程中試劑充分進入細胞，脫蠟完成後需要對細胞進行通透操作，說白了就是在細胞上打洞。打洞的試劑常用的有TritonX-100和蛋白酶k（常用濃度網上都有）。從這裡開始，染色步驟開始出現一些精緻操作：由於切片很小，加上某些試劑很昂貴（比如抗體），所以我們希望儘量少用點試劑。於是就出現了直接把試劑點在切片上的做法（而不是像脫蠟那樣用上幾百毫升液體浸泡切片），這樣也許只需100微升試劑就足夠了。但是液體在玻片上不一定能固定邊緣，很可能會淌走，所以就需要把試劑“圈”在組織周圍，於是一個用於畫“圈”的神筆就誕生了（請見下圖）。
不用本俠提示，小夥伴們也能猜到，這樣一支筆肯定很貴。奈何天無絕人之路，不想花重金買這支筆的，用指甲油也可以喲，不要怪我沒提醒你指甲油也有高低檔次，但效果沒差。細胞通透完，再把切片放入用PBS配製的3%H2O2中浸泡15min（這時用的染色缸可以是沒有卡槽的大缸，也可以用有卡槽的小缸，如果用有卡槽的，需要把載玻片一張張插進去），以滅活內源性過氧化物酶（請參見小貼士2）。這麼做的原因是抗體孵育時用的二抗通常是HRP（辣根過氧化物酶）標記的（當然也有其它酶標記的，比如鹼性磷酸酶標記，看你買哪種了。但請注意，標記不同，顯色底物也要相應更換），顯色的時候我們會用過氧化物酶的底物與HRP反應，如果樣本本身也含有過氧化物酶的話，那麼底物也會與樣本中的過氧化物酶反應，造成假陽性，所以我們需要事先用H2O2把樣本中自帶的過氧化物酶滅活。
抗原修復
接下來的步驟就是期待已久的甲醛或多聚甲醛固定樣本所需要做的“抗原修復”（請參見小貼士3）。比較常用的修復方法是熱修復，有些地方也叫高溫修復，還有的地方叫做微波修復，做法也很簡單，先把修復液（關於修復液，請參見小貼士4）放進微波爐，高火5min讓修復液沸騰，然後把切片放到修復液裡，再放進微波爐，中火10-15min進行修復，最後自然冷卻（約20min）即可。但是有些抗體是有特殊要求的，比如需要進行酶修復，那麼就必須按照抗體說明書來。所以進行抗原修復之前，請先仔細閱讀抗體說明書，如果說明書沒有說明，可以嘗試用熱修復。修復完就是我們熟悉的封閉過程了，用PBS配製5%的BSA，點到樣本上，37℃（室溫也行）孵育1h就可以了。封閉液的濃度可以自己根據需要調整，但是本俠建議大家不要提高到10%，會比較粘稠，效果沒覺得有多好，但是卻很難洗掉。一抗和二抗的孵育，與Western類似，不同的是，稀釋好的抗體也是點在切片上的，體積很少。抗體都可以用1%BSA稀釋，也有實驗室直接用PBS稀釋抗體，都行吧。一抗孵育先用4℃過夜，然後37℃再孵育1h（請參見小貼士5），二抗用37℃，1h即可。染色過程中所有的洗滌步驟都在有卡槽的染色缸進行，將載玻片插入染色缸，倒入PBS，放在搖床上洗滌。
顯色
最後還有一步就是顯色，這一步也很簡單，買一個市售的DAB試劑盒（如果二抗是HRP標記的話，如果不是HRP，那就什麼酶買什麼底物），按照說明書操作即可。染完我們想要染的目的蛋白，一般我們還會再復染一下蘇木素，這樣可以把細胞識別出來，目的是防止染出來的目的蛋白不在細胞上，是個假陽性結果。蘇木素復染同樣很簡單，買來後直接滴在染好目的蛋白的切片上，等1-2min，用水沖洗多餘的染液就行了。所有操作做完以後，如果標本想長期保存，需要進行封片，常用的封片劑是中性樹膠，本俠封片不專業，就是等染色標本風乾後，直接將中性樹膠點在樣本上加蓋玻片，好像也沒什麼問題。但是有些顯色液不適合用中性樹膠封片，比如需要用水溶性的封片劑，那麼小夥伴們需要根據底物要求選擇合適的封片劑。
到這裡為止，免疫組化所有的步驟就介紹完了，本俠對於免疫組化知之甚少，不足之處，忘指正，茫茫學海，大家共同進步！最後防止小夥伴們被本俠說的凌亂了，附上一張流程圖，祝組化路上順利爾！
豬豬俠小貼士
1、 60℃烤片的時間不一定嚴格45min，因為每個人選擇切片的厚度不一樣，需要加熱的時間肯定也不同，時間長短選擇的依據是石蠟開始融化成小液珠狀但切片又不掉。烘箱的溫度倒是需要比較注意一下，溫度低了石蠟不容易化，溫度高了又容易化過頭。控制烘箱的溫度本俠喜歡用溫度計自己調整，因為每家烘箱的溫度傳感器靈敏度不一定相同，控制出來的溫度肯定有差異，所以對於做實驗的質控不利。
2、這裡有一個飽受爭議但卻無結論的問題，就是究竟應該先滅活內源性過氧化物酶還是先進性抗原修復。業內兩種做法都有，如果有小夥伴不放心，先滅活再修復，修復完了再滅活一次也不是不可以，簡直了。
3、修復的方法本俠只介紹了自己用過的兩種，一種是熱修復，一種是酶修復。市面上還有高壓修復，具體怎麼做本俠就不清楚了，據說效果比較猛烈。
4、熱修復的修復液其實是比較常規的試劑，常見的是枸櫞酸鈉修復液（又叫檸檬酸鈉修復液），配方也是大同小異，大家可以度娘，本俠也給大家提供一個配方，小夥伴們自便：0.01M枸櫞酸鈉（檸檬酸鈉）緩衝液：稱取檸檬酸0.4g、檸檬酸三鈉3g，用800ml H2O溶解後定容至1000ml，此時PH值應為6.0左右，如果不是6.0，就需要調整PH值，但是很不好意思，本俠忘了拿什麼調了，如果酸了應該可以用氫氧化鈉，因為不會引入新的離子，但如果鹼了好像只能用檸檬酸調了，用別的酸就引入新的離子了，只能幫你到這裡了，對不住啊，哈哈。對了，說到PH值，用來洗滌的PBS據說PH值需要控制在7.4-7.6，不然結果會有驚無喜。
5、有很多小夥伴擔心抗體是不是能結合在蛋白上，這裡本俠很負責任地告訴大家，如果排除脫蠟、修復、通透等操作不當，同時排除抗體太差勁，那麼抗體即使在4℃，也會很快結合在蛋白上。有一次本俠操作失誤，把一抗加到樣本上放4℃半個小時後發現不該加這個抗體，於是洗了，但是最後發現還是染出來了，多尷尬。
對第十一講（也就是免疫組化第一講）中“未固定冰凍切片”的重要說明：
本俠說過如果做冰凍切片的話，取下來的組織是可以不用固定直接切片的，但是切完片以後在染色前還是要固定一下的，這樣切片不易脫落且據說固定後的切片也可放到-80℃長期保存（這樣一來本俠第十一講說的不固定的冰凍樣本必須馬上做完組化似乎就不對了，對不住大家。但是由於丙酮固定後長期保存本俠沒試過，所以效果也不敢保證啊，小夥伴們看著辦吧，呵呵噠）。固定液是“負二十度預冷過的丙酮，純的丙酮”。冰凍切片完成以後，把切片放室溫靜置晾乾，然後把預冷的丙酮加到切片上5-10min即可。由於丙酮不影響蛋白質結構，所以固定後的樣本不用進行抗原修復。
更多精彩內容搜索關注微信公眾號"醫工薈"
閱讀更多 mufflerBME 的文章
