本文介紹了一種全新的層析澄清策略——用於單抗純化的精細澄清階段，可以有效去除影響Protein A層析捕獲性能的可溶和不可溶雜質，達到提高Protein A層析性能的作用，從而促使單抗生產工藝向平臺化和精簡化發展。
生物製藥產品在開發的所有階段使用平臺化的生產工藝，可以極大的縮短生物製藥候選產品從研發到臨床再到商業化的時間週期。對於單抗產品，這就意味著需 要穩健的和高性能的Protein A親和層析。然而，整個行業還是面臨著Protein A親和層析後純度和再現性呈不穩定、多變性的挑戰。現階段單抗純化工藝流程如上圖所示：
單抗純化整個工藝流程中，僅僅通過Protein A親和層析這一步，即可以獲得純度很高的產品。然而，相比理想模型系統中親和層析可以達到99.9-99.99%的純度，現階段由於單抗產品的高效價和高密度影響，Protein A親和層析只可以達到95-98%的純度。而這種現象在親和層析階段都普遍存在，因此，這就要求在親和層析工藝後，增加精製層析步驟，以便獲得更高純度的產品。Protein A親和層析性能的多變性嚴重限制了單抗純化工藝的平臺化進程，從而延長了單抗產品從研發到臨床的時間週期，進一步限制了單抗產品商業化的進程。這裡介紹了一種策略，具有很強的操控性，可以很好的提高Protein A層析後的純度，簡言之，即通過層析澄清的方式去除Protein A中的雜質，從而得到高純度的Protein A洗脫液。
採用3M EmphazeTM AEX複合澄清膜進行層析澄清
傳統的澄清過濾依賴於深層過濾來去除細胞和其他的不溶雜質，這種方式的最大限制在於不能去除像DNA/蛋白質-核染色質複合物等這種可溶性雜質。研究表明，細胞培養液中高濃度的核染色質被認為是影響Protein A層析柱性能的一種主要成分，在純化工藝的很多階段它扮演著催化沉澱的角色[1,2］。為了解決可溶性蛋白的去除問題，我們引入3M EmphazeTM AEX用於澄清過濾中精細過濾階段，3M EmphazeTM AEX是一種全合成澄清膜，依賴擁有高載量的Q-功能基團的水凝膠和0.2μm的濾膜，在純化工藝的澄清階段高效率地去除可溶和不可溶雜質[3,4］。
澄清效果分析
採用動態光散射（NANO-Flex, Microtrac, USA）分析技術來表徵傳統深層過濾和層析澄清技術濾液的特性，結果顯示層析澄清可以得到更高澄清度和更高純度的濾出液。事實上，層析澄清策略創造了一種單抗產品佔主導的工藝流程，這種策略明顯增強了Protein A層析柱從HCP雜質中分離單抗的性能[4]。
Protein A後產品純度和病毒滅活後的穩固性
採用兩種不同澄清方式的濾液，通過標準的Protein A層析柱進行純化，結果表明，層析澄清方式明顯增強了Protein A 層析柱的捕獲性能，得到了HCP/DNA含量較低的高純度產品。Protein A洗脫液純度的提高，極大的降低了病毒滅活中和液（VIN）的濁度。結果表明，Protein A洗脫液純度的提高也增強了VIN的穩固性，很好的提高了工藝的操控性和簡化了工藝流程。這就意味著可以省略到VIN後的深層過濾步驟，從而減少了產品的損失。
結論
這項工作展示了採用3M EmphazeTM AEX複合澄清膜技術應用於蛋白純化工藝的一種新策略。這種新策略可以高效的去除干擾Protein A層析性能的可溶和不可溶雜質，因此可以同時實現澄清和純化兩個目的；另一方面，這種性能的提高直接影響到下游親和層析後純度的提高和病毒滅活中和液濁度的降低。另外，這種策略對於單抗純化工藝具有巨大的意義，可以使純化流程平臺化和精簡化，而這種策略更大的意義在於，在單抗產品開發的任何階段和生產的任何規模都可以使用3M ZetaPlusTM和EmphazeTM AEX平臺的不同規格產品，對整個工藝流程進行整改和優化，從而達到最優化的目的。
最後特別感謝FUJIFILM Diosynth Biotechnologies U. S. A對於該研究內容的支持。
【參考文獻】
[1]Emerging Challenges to Protein A, P. Gagnon, Bioprocess International, 2013.
[2]Nonspecific interactions of chromatin with immunoglobulin G and Protein A, and their impact on purification performance, P. Gagnont et. Al, Journal of Chromatography A, 2014.
[3]Anion-Exchange Chromatographic Clarification: Bringing simplification, Robustness, and savings to mAb Purification, A. Castro-Forero., et. al., Bioprocess International, 2015.06.
[4]Development of the Next Generation Purification Platforms Through Novel technologies and Holistic Process Engineering Approaches, A. M. Voloshin, BPI West, 2016.03, Oakland, USA.
本文作者就職於3M中國有限公司 。
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