04.02 肝癌精准医学之路：面临的挑战

单位：复旦大学附属中山医院复旦大学肝癌研究所

目前肝癌的临床管理主要包括对高危人群的定期监测、早期发现、早期治疗以及对肝癌患者的积极治疗和随访。治疗主要包括手术治疗和局部治疗。早期肝癌患者首选外科手术治疗，术后5年生存率达50%～70%，但肿瘤复发转移率也高达50%～80%。肝移植较肝叶切除具有复发率低及生存率高的优点，但供体短缺限制其在肝癌治疗中的应用。肝动脉化疗栓塞、射频微波、酒精局部注射、放疗、中医药以及索拉菲尼是多数中晚期肝癌和肝癌术后复发患者的主要治疗方式，对延缓肝癌进展和延长生存期具有一定作用。随着大数据时代的到来，精准医学为肝癌的临床管理注入新鲜血液，为肝癌研究提供新的思路。其旨在通过人类基因组数据及相关大数据平台对疾病内在生物学特征和临床表型等进行整合，并依据整合结果对疾病亚型进行分子水平的细分，从而提供精准的诊疗方案，且在评估疗效和预测预后等方面具有一定的优势。但由于肝癌本身的基因组不稳定及高度异质性导致肝癌精准医学实践之路困难重重。本文通过阐述肝癌基因组不稳定及其异质性，探讨肝癌液体活检及靶向药物研发所面临的挑战。

1.基因组不稳定性

基因组不稳定是癌症发生的重要分子基础，有2种表现形式：有丝分裂缺陷相关染色体不稳定性（CIN）及DNA代谢缺陷相关微卫星不稳定性（MIN）。一般来说，CIN较MIN预后更差，因为CIN更易引起基因组的严重突变，如染色体碎裂、拷贝数异常等。多数肝癌细胞存在明显的基因组不稳定性，且以CIN较为常见。染色体臂的缺失突变以及染色体臂获得性突变，在肝癌中多次被报道。其中，4q及16q的缺失在乙肝相关性肝癌中发生频率较高，染色体臂1p缺失在分化较好的肝癌细胞或不典型增生结节以及肝硬化结节中检出率较高。CIN变异小鼠模型也证实，高程度CIN变异具有自发肿瘤倾向，如CIN相关基因Sgo1缺陷的小鼠易自发肝癌。

当代肿瘤学研究和基因深度测序等方法已确定多种癌症相关基因突变和表观遗传学错配与癌症基因组不稳定性密切相关。在肝癌细胞中，这些基因主要涉及以下几条信号通路：（1）原癌基因信号通路；（2）DNA损伤修复信号通路；（3）氧化应激途径；（4）细胞周期；（5）免疫调节信号通路。其中，原癌基因信号通路异常主要发生于Wnt、Smad及表皮生长因子受体（EGFR）等信号通路相关基因，如Wnt通路中β-catenin基因CTNNB1（20%～40%）、Axin1（9%～13%）和Zic3（5%）基因，Smad通路中Wwp1（9%）基因，以及EGFR通路中Errfi1（5%）基因等。肝癌中这些基因通常发生功能获得型突变，导致原癌基因信号通路活化，进而引起低级别CIN和基因组不稳定。肝癌中DNA损伤修复信号通路突变以TP53基因为代表，约35%～50%肝癌中含TP53突变。该基因在维持基因组稳定性中发挥重要作用，其功能缺失可引起中心体扩增、异倍体细胞繁殖以及染色体不稳定等，尤其当TP53突变合并抑癌蛋白pRb功能缺陷或纺锤体检测点缺陷时，更易引起高级别CIN和基因组不稳定。其他肝癌细胞中常见突变基因还包括CDKN2A、TERT和MLL2等，参与细胞周期、氧化应激、免疫炎性反应等信号通路。除癌症相关基因异常外，乙型肝炎病毒（HBV）及丙型肝炎病毒（HCV）感染也是诱导基因组不稳定性发生的重要原因。其主要与以下3种途径相关：（1）病毒蛋白直接干扰有丝分裂过程，引起CIN；（2）病毒基因整合至宿主基因组的特异位点，影响癌症相关基因的表达和功能；（3）持续性慢性炎性反应进一步加重肝癌基因组不稳定性。基因组不稳定是肝癌高度异质性、治疗抵抗和肿瘤复发转移的重要分子基础，同时增加肝癌精准病理诊断分型和精准治疗的难度。

2.肝癌异质性

肝癌异质性是精准医学研究的重要内容之一。从病因上看，多数肝细胞性肝癌的发生与慢性肝病（包括肝炎病毒感染、酒精相关肝炎、非酒精性脂肪肝）、致癌物暴露（如黄曲霉素等）和遗传等因素有关。慢性肝损伤导致肝细胞死亡、氧化应激、炎性反应、再生和纤维化等，在此不良环境中，引起DNA损伤，驱动基因发生突变，环境抵抗的优势细胞克隆亚型存活并扩增，从而导致肝癌的发生。致病因素多变是不同患者间肝癌异质性的基础。在肝癌进展过程中，微环境的变化进一步促进肝癌细胞发生变异，压力选择下，产生更多克隆亚型，导致肝细胞性肝癌在基因组学、形态学和肿瘤进展征象等方面均表现出高度异质性。因此，肝癌异质性包括时间和空间异质性，时间异质性是指在肝癌进展过程中不同阶段异质性的逐渐增加，空间异质性表现在肝癌内部不同区域的肿瘤细胞存在不同的特征以及肝癌患者间的肿瘤生物学行为差异。

肝癌细胞基因组不稳定性是肝癌具有高度异质性的重要原因。不同于其他恶性肿瘤如乳腺癌或肺癌等具有多个决定肿瘤行为的遗传变异标志分子，肝癌细胞基因变异谱范围广，缺乏明确的遗传变异特征。COSMIC数据库提供的肝癌组织高频突变基因如图1所示，除TERT、TP53和CTNNB1突变频率较高外，其他基因的突变率相对较低，均＜10%。肝癌组织中甲基化异常基因已发现多达数千个，且在肝癌发生早期甚至在肝细胞不典型增生时期，DNA甲基化异常即可出现，并随着肝癌发展和异质性增加，DNA甲基化异常程度也进一步增加。突变基因及表观遗传变异基因的数目之多、范围之广增加了肝癌精准分子病理诊断的复杂性，提升了靶向治疗研究的难度，是肝癌精准医学研究面临的最大挑战。

3.肝癌液体活检的难度

液体活检是指检测血液或体液分泌物中的肿瘤相关分子标志。目前研究较多的检测内容包括循环肿瘤DNA（ctDNA）及循环肿瘤细胞（CTCs）。ctDNA及CTCs来源于原发肿瘤DNA或肿瘤细胞的释放入血，因此能反映原发肿瘤的情况。与传统组织病理活检比较，液体活检具有非侵入性、易操作性和可动态监测等优点，克服了空间和时间异质性的极限。可以通过检测ctDNA及CTCs的分子特征分析癌症的基因组信息，对癌症进行精准的分子病理诊断，并提供靶向治疗指导。液体活检的连续取样功能有助于肝癌高危人群的早期诊断，治疗反应的实时监测，耐药评估，以及提前预测肿瘤的转移复发。如TP53基因突变是肝癌组织中最常见的突变，249T位点是TP53基因突变热点，该突变已证实能在肝癌患者外周循环和尿液DNA中检测到。研究显示，在严重的肝硬化患者外周循环DNA中也能检测到TP53249T突变，肝硬化是肝癌的癌前病变。这项结果提示，TP53249T突变可能在肝癌发生早期或癌前病变阶段就已出现并释放至外周循环中，进一步研究有望对这部分ctDNA检测阳性（TP53249T突变）的肝硬化患者进行更为密切的影像学及甲胎蛋白随访，以期对早期病灶进行积极处理。尽管液体活检显现出巨大优势，但由于肝癌异质性的存在，液体活检也仅能反映部分原发肿瘤的情况，且肝癌本身缺乏明确的遗传变异标志性分子，患者循环中CTCs及ctDNA的浓度低，这些因素限制了液体活检在肝癌临床上的应用。以TP53249T突变为例，ctDNA中发现该突变也与结肠癌和乳腺癌等其他类型肿瘤有关，因此，循环DNA中发现该位点突变表明，患者体内可能有肿瘤存在，但特异性太低，对肝癌的诊断仅具有提示意义。

4.靶向药物研发的困境

肝癌对传统化疗药物不敏感。索拉菲尼是目前唯一被FDA批准用于晚期肝细胞性肝癌治疗的分子靶向药物。该药物是一个多激酶抑制剂，其作用靶点主要包括血管内皮生长因子受体（VEGFR）、血小板源生长因子受体（PDGFR）和KIT等。但索拉菲尼的临床试验结果不尽如人意，与安慰剂比较，其仅能延长晚期肝细胞癌患者2～3个月的生存期。且在索拉菲尼治疗过程中，部分患者一开始对治疗有反应但很快产生耐药，而对索拉菲尼治疗失败的患者进行二线药物的临床试验也多以失败告终。

肝癌精准医学研究的重要内容之一是根据基因和表观特征将异质性的肝癌细分成不同亚型，并制定精准的治疗方案。随着肿瘤靶向药物研究的深入，其他类型肿瘤信号通路抑制剂治疗肝癌的临床试验相继展开，如抗血管生成分子制剂、c-Met抑制剂、mTOR抑制剂、MEK抑制剂和免疫调节剂等。一项MEK抑制剂联合索拉菲尼治疗中晚期肝癌的Ⅱ期临床试验结果显示，两药联用与单用索拉菲尼比较并不能延长肝癌患者总生存期，但4例（4/69）肝癌患者ctDNA中存在KRAS、NRAS突变，其中3例经refametinib治疗后肿瘤得到明显缓解，提示依据精准的肝癌分子遗传学分型进行临床试验，尽量减少不同肝癌患者之间的异质性，可提高精准治疗疗效，有望促进靶向制剂的研发效率。然而，肝癌具有高度异质性，目前未发现明确的标志性遗传变异分子，TERT、TP53和CTNNB1等基因突变，尽管在肝癌中已被证实为高频突变基因，但仍未明确其在肝癌进展过程中发挥“驱动基因”还是“路过基因”作用，限制了肝癌精准靶向药物临床试验的开展。

5.结语

肝癌精准医学研究面临最大的挑战是肝癌基因组不稳定性，导致肝癌的高度异质性。由于肝癌缺乏明确的生物标志基因，精准医学很难对肝癌进行分子病理水平的精准诊断和治疗，从而影响肝癌液体活检技术的应用和分子靶向药物的研发。因此肝癌精准医学研究任重而道远。但随着大数据计算工具和云计算等手段的不断进步，对肝癌基因分子水平异质性的认识程度也会日益增加，未来肝癌精准医学在肝癌临床管理中的重要性也将日益突出。

节选自：《实用肿瘤杂志》2018年第33卷第1期